游 勇，吳曉玉，廖家富，吳生文，廖 昶，王 飛，胡余糧，林鈺寬，孫輝凡，丁忠濤

（1.江西省農業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045；2.江西農業(yè)大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045；3.四特酒有限責任公司，江西 樟樹 331200）

我國白酒生產采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵生產方式，用曲釀酒是我國白酒生產的特色。微生物制曲技術被譽為中國“第五大發(fā)明”。釀酒先輩們從實踐中總結出了“曲乃酒之骨”“有好酒必有好曲”“曲定酒型”等精辟論斷。大曲不僅是白酒固態(tài)發(fā)酵生產所必需的接種劑和糖化發(fā)酵劑，同時大曲生產過程中產生的大量微生物代謝產物和香味物質也直接或間接地形成白酒的風味成分，對白酒的香型和風格有決定作用。

在不同香型的白酒大曲中，微生物菌群結構具有明顯的差異性。在高溫白酒大曲中占優(yōu)勢地位的微生物菌群為耐熱和嗜熱微生物，比如芽孢桿菌和耐熱的霉菌。目前已經從多種香型的白酒大曲中篩選分離到芽孢桿菌功能菌株。向慧平等從發(fā)酵階段和儲存階段的濃香型大曲樣品中均分離到了地衣芽孢桿菌。劉桂君等從清香型白酒大曲和酒醅中分離鑒定出12 株地衣芽孢桿菌。黃曉寧等從清香型大曲中優(yōu)選出地衣芽孢桿菌B.L-1 和枯草芽孢桿菌B.S-1，并將其強化接種應用于白酒釀造過程，發(fā)酵結束的酒醅中四甲基吡嗪等代謝物的含量顯著升高。在醬香型高溫大曲中芽孢桿菌更是大量存在。朱德文等從醬香型高溫大曲中分離到1 株產焦香、醬香可用于高溫型大曲酒增香提質的解淀粉芽孢桿菌MT6。從茅臺大曲核心層分離到的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能夠產生眾多茅臺酒的特征香味化合物。

特香型白酒是中國白酒的十二大香型之一，形成了“濃頭醬尾清中間，三香俱備猶不靠”的典型風格。特香型白酒的風味物質與釀造用的大曲密切相關。特香型大曲屬于中偏高溫曲，其制曲原料獨特，由面粉、小麥麩和酒糟加水攪拌壓制而成，在曲房中自然固態(tài)發(fā)酵的頂溫在55 ℃左右。在特香型大曲制曲過程中摻入新鮮出窖酒糟，人為接種了釀造特香型白酒的特有微生物，調節(jié)曲坯的初始pH 值，使有益菌在固態(tài)發(fā)酵初期即處于競爭優(yōu)勢地位，具有明顯的特色。雖然之前從特香型大曲中分離到一些微生物菌株，但目前還沒有鑒定出代謝產生特香型大曲曲香和特香型白酒風味物質的菌種，影響特香型白酒品質的關鍵微生物還未確定。

本試驗從特香型大曲火圈層中分離篩選出1株具有水解淀粉活性的耐高溫細菌菌株，結合菌株形態(tài)學、生理生化特性鑒定和基因序列同源性分析對其進行了菌種鑒定，檢測了其固態(tài)發(fā)酵產生的揮發(fā)性風味化合物，并測定了其液態(tài)發(fā)酵的淀粉酶活力。本研究為進一步研制強化大曲提供了菌種資源，同時為揭示功能細菌影響特香型大曲品質的機理提供了一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

特香型大曲曲塊取自四特酒有限責任公司大曲生產曲房。

1.1.2 儀器設備

滅菌鍋、超凈工作臺、中藥粉碎機、渦旋混勻儀、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、光學顯微鏡、酶標儀、掃描電子顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、冷凍高速離心機、PCR 儀、凝膠成像儀、Agilent 7890A 氣相色譜儀配備5975C質譜儀。

1.1.3 試劑和培養(yǎng)基

細菌基因組DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和普通生化試劑購自北京索萊寶科技有限公司。PCR 擴增所用引物由湖南擎科生物公司合成。實驗所用試劑均為分析純。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉2.0，牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0～7.2。

LB 培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

產酶培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉5.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，KHPO2.0，MgSO·7HO 0.5，CaCl0.2，pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐高溫細菌菌株的分離

選擇四特酒大曲生產曲房的優(yōu)質出房曲，用中藥粉碎機將曲塊的火圈層粉碎，稱取2.0 g粉碎后的大曲于250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 滅菌生理鹽水，封口后將樣品置于37 ℃恒溫搖床中振蕩30 min即得大曲懸液。將大曲懸液置于水浴鍋中，55 ℃水浴處理2 d。取1 mL 處理后的大曲懸液，用無菌生理鹽水將大曲懸液進行梯度稀釋。將10到10稀釋度的大曲懸液各吸取100 μL 到LB 固體平板上涂布均勻，每個稀釋度做3 個平行，待懸液充分吸收后倒置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。

1.2.2 耐高溫解淀粉細菌菌株的篩選

將LB 平板上的耐高溫細菌單菌落點接種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h 后將平板用盧戈氏碘液染色，選取菌落周圍有透明圈產生的單菌落作為解淀粉細菌初篩菌株。復篩時隨機選取每個初篩菌株的3 個單菌落分別測量透明圈直徑（H）和菌落直徑（C），根據兩者比值的平均值大小初步確定初篩菌株淀粉水解酶活性的高低，挑取淀粉水解活性最大的單菌落進行純種分離、斜面培養(yǎng)并編號保藏。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學觀察

將分離到的具有淀粉水解活性的耐高溫細菌菌株進行平板劃線，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落的形態(tài)特征，取單菌落培養(yǎng)物進行革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察。

掃描電子顯微鏡制片及觀察：挑取培養(yǎng)平板上的細菌單菌落均勻涂于滴有蒸餾水的蓋玻片上并在酒精燈火焰上方烘干，然后把蓋玻片置于2.5 %的戊二醛磷酸緩沖液（pH7.0）中4 ℃固定過夜，取出蓋玻片用0.15 %的戊二醛磷酸緩沖液（pH7.0）沖洗殘余的戊二醛，再依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的無水乙醇進行梯度脫水。然后用乙醇-叔丁醇溶液（V/V=1∶1）和100 %叔丁醇置換乙醇，將蓋玻片進行干燥處理。蓋玻片經離子濺射儀噴鍍后在掃描電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化實驗鑒定

按《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對獲得的菌株進行生理生化實驗，具體實驗方法參照微生物學實驗手冊。

1.2.3.3 細菌總DNA提取和基因擴增

細菌總DNA 的提?。簩⒈２氐木昶桨鍎澗€活化后挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體。菌體基因組DNA 用Solarbio Bacteria DNA Kit 提取，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。PCR 擴增采用擴增芽孢桿菌基因的通用引物UP-1:5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'和UP-2r:5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃復性1.5 min，反應30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3.4 gyrB基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的結果，將目的條帶用Solarbio DNA Extraction Kit 回收，操作步驟按照試劑盒說明書進行。PCR 目的條帶的回收產物送擎科生物公司測序。測序結果經序列拼接后用NCBI 在線工具Blast在Gene Bank 內與已公布其他細菌基因序列進行比對，采用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining 算法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstraps法檢測1000次。

1.2.4 發(fā)酵上清液淀粉酶活的測定

將菌株單菌落接種到裝有50 mL LB 培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，以37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。以2 %(v∶v)的接種量接種到裝有50 mL 產淀粉酶培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中并在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)60 h。取不同培養(yǎng)時間的菌液，4 ℃下以6000 r/min離心10 min，并用0.22 μm濾膜過濾獲得發(fā)酵上清液，然后以DNS 法對上清液的淀粉酶活力進行測定。在40 ℃、pH5.6的條件下，以每分鐘水解底物可溶性淀粉生成1 μmol 還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.2.5 菌體生物量的測定

取與上述測定發(fā)酵上清液淀粉酶活同批次、相同培養(yǎng)時間的菌液，用酶標儀測定經適當稀釋的菌液在600 nm 波長下的吸光度值，以取樣時間為橫坐標，以OD值為縱坐標繪制菌株的生長曲線。

1.2.6 模擬大曲固態(tài)發(fā)酵

參照文獻模擬大曲制作工藝，采用市售普通小麥和麥粉，用蒸熟小麥粒（麥?！名湻?1∶1，與等量水混合浸泡過夜、蒸熟）作為大曲固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。每150 mL 錐形瓶中裝入30 g 麥粒固體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min。將保藏的菌株平板劃線活化后挑取單菌落接種于液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)18 h，按2%的比例接種于麥粒固體培養(yǎng)基中。按照37 ℃，48 h；45 ℃，48 h；55 ℃，48 h的溫度調節(jié)程序在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后分析模擬大曲的揮發(fā)性香氣組分。

1.2.7 揮發(fā)性風味化合物分析

采用固相萃取-氣相色譜/質譜聯(lián)用法（SPEGC-MS）對固態(tài)發(fā)酵后模擬大曲的揮發(fā)性物質進行鑒定分析。用脂肪酸型萃取針置于三角瓶中發(fā)酵麥粒培養(yǎng)基上方0.5 cm處萃取20 min。萃取完畢后將萃取頭插入GC 進樣口，250 ℃熱解吸3 min。氣相色譜條件：采用Agilent 7890A/5975C 型氣質聯(lián)用儀，毛細管柱為DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），自動不分流進樣，流動相為He，流速1 mL/min。進樣口和檢測器溫度為250 ℃；柱溫程序為35 ℃保持2 min，以2 ℃/min 的速率升溫到85 ℃，然后以8℃/min 升溫到250 ℃，保持5 min。質譜條件：采用EI（Electron Impact Ionization）離子源，電子轟擊能量70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍30～450 u。用NIST 11 譜庫對色譜峰進行檢索定性分析。

2 結果與分析

2.1 耐高溫解淀粉細菌菌株ZRF-1的分離

為了從特香型白酒大曲中分離篩選具有水解淀粉活性的耐高溫細菌菌株，將55 ℃高溫處理2 d的四特酒大曲懸液梯度稀釋后在LB 平板上50 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。將獲得的耐高溫細菌單菌落點接種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h 后將平板用盧戈氏碘液染色，選取菌落周圍有透明圈產生的菌株作為初篩菌株。

進一步將初篩菌株分別點接種3 個單菌落于淀粉篩選平板上，通過比較淀粉水解透明圈直徑和菌落直徑的比值，篩選到淀粉水解活性相對最大的一種細菌菌株，編號為ZRF-1。圖1 所示為ZRF-1菌株在篩選培養(yǎng)基上的淀粉水解透明圈。

圖1 ZRF-1菌株的淀粉水解圈圖

2.2 耐高溫解淀粉菌株ZRF-1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

將ZRF-1菌株在LB固體培養(yǎng)基平板上進行劃線，如圖2 所示，37 ℃培養(yǎng)24 h 的ZRF-1 菌株菌落顏色為淡黃色半透明，黏稠呈蠟油狀，表面濕潤有光澤，邊緣光滑，單菌落形狀不規(guī)則。ZRF-1 菌株的革蘭氏染色結果顯示菌體細胞被均勻染成紫色，確定ZRF-1 菌株為革蘭氏陽性細菌。如圖3 所示，從掃描電子顯微鏡的形態(tài)觀察結果來看，ZRF-1 菌株的細胞呈長桿狀，菌體細胞直徑為0.5～0.7 μm，長度為1.5～2.5 μm，確定ZRF-1細菌菌株為桿菌。

圖2 ZRF-1菌株的菌落形態(tài)圖

圖3 ZRF-1菌株的掃描電鏡圖

2.2.2 生理生化實驗鑒定

如表1 所示，生理生化實驗鑒定結果發(fā)現(xiàn)ZRF-1 菌株酪蛋白水解和VP 試驗結果呈陽性，最高耐鹽濃度為10%，對葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和甘露醇等的發(fā)酵實驗均為陽性。參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，ZRF-1 菌株的生理生化特性與革蘭氏陽性芽孢桿菌屬細菌一致，初步確定ZRF-1菌株為芽孢桿菌類細菌。在50 ℃恒溫搖床液體培養(yǎng)條件下和50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)條件下，ZRF-1 菌株均能夠正常生長，證明ZRF-1菌株為耐熱芽孢桿菌。

表1 ZRF-1菌株的生理生化特征

2.2.3 分子生物學鑒定

細菌中有許多在進化過程中保守的，且基因序列的變異速度比16S rDNA 基因快的功能基因。在大多數細菌中都存在的DNA 促旋酶(gyrase)中B 亞單位基因是這一類基因的典型代表。與可以從屬水平上鑒定細菌的16S rDNA 基因相比，基因在近緣種和種以下分類單元的鑒定方面更具優(yōu)越性。因此本試驗選用gyrB 基因鑒定ZRF-1菌株的屬種。

以ZRF-1 菌株的基因組DNA 為模板，采用擴增芽孢桿菌gyrB 基因的通用引物UP-1 和UP-2r進行PCR 反應，得到大小約為1.2 kbp 的特異性條帶（圖4）。測序結果顯示ZRF-1 菌株的基因序列為1,188 bp。將此序列用NCBI 在線工具Blast同Gene Bank 數據庫中的基因序列進行比對，選擇其中的16 株標準菌株的基因參考序列，采用MEGA10.0 軟件，用Neighbor-Joining 算法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖4 所示，根據系統(tǒng)發(fā)育樹的結果，ZRF-1 菌株與多株地衣芽孢桿菌（）聚集為一支。

圖4 ZRF-1菌株gyrB基因擴增電泳圖及基于gyrB基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

基于基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，結合形態(tài)學特征、生理生化實驗鑒定結果，可以確定ZRF-1 菌株為地衣芽孢桿菌，命名為ZRF-1。

2.3 菌株ZRF-1的生長曲線與淀粉酶合成規(guī)律

由于芽孢桿菌分泌的淀粉酶大多為胞外酶，將ZRF-1 菌株單菌落接種到產淀粉酶液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min 的搖瓶發(fā)酵條件下培養(yǎng)60 h，根據不同培養(yǎng)時間的菌體生物量和發(fā)酵上清液的淀粉酶活力繪制ZRF-1 菌株的生長曲線，同時探究ZRF-1菌株搖瓶發(fā)酵的淀粉酶合成規(guī)律。

由圖5 可知，菌株ZRF-1 在搖瓶發(fā)酵的1～2 h快速進入對數期，在20 h 菌體濃度達到最大值。ZRF-1 菌株產淀粉酶活力在對數后期14 h 后快速增長，進入穩(wěn)定期后ZRF-1菌株產淀粉酶活力高且較穩(wěn)定，說明ZRF-1菌株產淀粉酶活力的大小與菌體的生長基本呈正相關。進入衰亡期52 h 后ZRF-1 菌株產淀粉酶活力仍有一定程度的增長，推測ZRF-1菌株發(fā)酵前期分泌的淀粉酶活性仍較高。

圖5 ZRF-1菌株的生長曲線與產酶量

2.4 ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產揮發(fā)性風味化合物活性分析

利用分離自特香型大曲火圈層的ZRF-1 菌株通過37 ℃，48 h；45 ℃，48 h；55 ℃，48 h 的溫度調節(jié)程序在培養(yǎng)箱中進行了模擬大曲固態(tài)發(fā)酵的實驗，并進一步對固態(tài)發(fā)酵產物的主要揮發(fā)性風味組分進行了測定，結果如圖6 和表2 所示。ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產生3-羥基二丁酮（乙偶姻）、[S-(R*,R*)]-2,3-丁二醇、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和四甲基吡嗪等揮發(fā)性風味化合物。乙偶姻在ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產生的揮發(fā)性物質中的相對含量最高，其次是2,3-丁二醇和四甲基吡嗪等吡嗪類風味化合物。

表2 ZRF-1菌株及空白實驗揮發(fā)性風味化合物的相對含量

圖6 菌株ZRF-1固態(tài)發(fā)酵產物揮發(fā)性風味化合物的GC-MS分析色譜圖

3 討論

耐熱和嗜熱微生物是中高溫白酒大曲中重要的優(yōu)勢功能菌。白酒大曲功能菌株與大曲中各種酶系的產生、大曲曲香的形成以及白酒特征風味物質的形成之間有著緊密的聯(lián)系。本研究從中高溫特香型大曲火圈層中分離篩選到1 株具有水解淀粉活性的耐高溫細菌菌株ZRF-1 并結合菌株形態(tài)學鑒定、生理生化實驗和分子生物學鑒定的方法將該菌株鑒定為地衣芽孢桿菌菌株。

大曲微生物產生的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯化酶等酶系在大曲固態(tài)發(fā)酵過程中降解底物并產生風味化合物或風味前體化合物。在利用產淀粉酶培養(yǎng)基對ZRF-1菌株進行搖瓶發(fā)酵過程中，從對數后期到穩(wěn)定期直到衰亡期前期ZRF-1 菌株產生的淀粉酶活力一直不斷增高且較穩(wěn)定。說明ZRF-1 菌株產淀粉酶活力的大小與菌體的生長基本呈正相關，而且可以推測ZRF-1菌株分泌的淀粉酶穩(wěn)定性較好，不會隨著發(fā)酵過程的進行而快速失活。后續(xù)實驗可以進一步克隆ZRF-1 菌株的淀粉酶基因，進行異源表達和純化，挖掘潛在的淀粉酶資源。

芽孢桿菌在白酒釀造過程中除了分泌多種水解酶，同時能夠產生重要的白酒特征風味物質。大量存在于高溫大曲中的芽孢桿菌的代謝產物經高溫條件產生的香味物質與醬香味有密切關系。例如從郎酒大曲中分離到的3 株大量產生四甲基吡嗪等吡嗪類及其前體化合物乙偶姻。張榮等從醬香型高溫大曲中篩選到3 株地衣芽孢桿菌并在其純培養(yǎng)發(fā)酵液中檢測到乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾。本研究利用ZRF-1 菌株模擬大曲固態(tài)發(fā)酵過程，通過分析固態(tài)發(fā)酵產物的揮發(fā)性化合物組分發(fā)現(xiàn)ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產生相對含量占85.86%的乙偶姻。乙偶姻是吡嗪環(huán)的前驅物，也是四甲基吡嗪最可能的前驅物。目前在醬香型白酒中檢測出較高濃度的吡嗪類風味化合物，其中四甲基吡嗪的含量最高。本研究檢測到四甲基吡嗪在ZRF-1 菌株固態(tài)發(fā)酵產生的揮發(fā)性化合物中相對含量達到3.45 %，也是遠高于2,3,5-三甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪等其他吡嗪類風味化合物的相對含量。除此之外還檢測到相對含量占比達到8.61%的2,3-丁二醇，2,3-丁二醇是酒類中極少數呈香的多元醇之一，產生像黃油和奶油的香氣。優(yōu)質特香型大曲隨著固態(tài)發(fā)酵過程的進行逐漸產生清晰的大曲外皮、火圈層和大曲核心三層結構，其中火圈層明顯的特香型大曲具有顯著的醬香味，而ZRF-1菌株分離自特香型大曲的火圈層，因此推測ZRF-1菌株參與特香型大曲曲香的形成，進一步可能對特香型白酒風味的形成產生一定的作用。

本研究從特香型大曲火圈層中分離篩選到1株具有水解淀粉活性的耐高溫地衣芽孢桿菌菌株，鑒定出其固態(tài)發(fā)酵產生的揮發(fā)性風味化合物，并驗證了該菌株液態(tài)發(fā)酵純培養(yǎng)的淀粉酶活力。后續(xù)實驗將繼續(xù)對地衣芽孢桿菌ZRF-1菌株的耐熱、產酶和產香特性做進一步的研究。本研究豐富了中高溫大曲中產淀粉酶功能菌的菌種資源，為進一步研制強化大曲將其投入到實際應用中提供了一定的理論基礎，同時為揭示功能細菌與特香型大曲曲香的形成以及特香型白酒風味物質形成之間的關系提供了一定的科學依據。