何猛超，羅家順，羅 軻，3，涂翠娥，張嬌嬌，胡景輝，韓興林

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.湖南南洲酒業(yè)有限公司，湖南南縣 413200；3.湖南中和生物科技有限公司，湖南益陽 413000；4.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015）

醬香型白酒作為中國傳統(tǒng)白酒之一，以醬香突出、濃郁豐滿、空杯留香持久的特點受到廣大消費者的青睞。醬香型白酒以高粱為原料，高溫大曲為糖化發(fā)酵劑經(jīng)高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、三年陳釀等工藝釀造。高溫大曲又稱“細(xì)菌曲”，作為醬香型白酒特有的曲種，含有多種微生物以及豐富的酶系，是醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物的主要來源，同時賦予醬香型白酒獨特的香氣和風(fēng)味。酒曲質(zhì)量的好壞很大程度上影響白酒的品質(zhì)，由于不同地區(qū)、不同白酒企業(yè)使用的高溫大曲不同，導(dǎo)致生產(chǎn)的醬香型白酒品質(zhì)各異。因此，研究高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，尤其是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，有利于調(diào)控醬香型高溫大曲的制曲工藝，對醬香型白酒的優(yōu)質(zhì)釀造具有深遠(yuǎn)意義。

隨著現(xiàn)代技術(shù)的高速發(fā)展，高通量測序技術(shù)在白酒行業(yè)的運用十分廣泛，主要用于研究酒曲、釀造環(huán)境、酒醅等微生物多樣性。近年來，高通量技術(shù)在醬香型白酒行業(yè)的研究中逐漸普遍，利用高通量技術(shù)解析高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)及功能，結(jié)合傳統(tǒng)可培養(yǎng)方式篩選、分離功能微生物，兩種技術(shù)的聯(lián)用能更好地解析高溫大曲的微生物多樣性，對深入研究高溫大曲中不同微生物的產(chǎn)酶、產(chǎn)香特性具有重要意義。

茅臺酒是我國醬香型白酒的典型代表，其使用的高溫大曲也是醬香型白酒行業(yè)公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)大曲。以茅臺大曲為對照，研究其他醬香型白酒企業(yè)的高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)，對比分析兩者的微生物差異性，將有助于企業(yè)調(diào)控制曲工藝，提升產(chǎn)品的品質(zhì)。湖南南洲酒業(yè)有限公司，具有百年釀酒歷史，致力于以稻米、高粱、小麥為主要原料的湖南區(qū)域特色的酒類產(chǎn)品開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)研究，釀造的醬香型白酒選用貴州茅臺地區(qū)生產(chǎn)的紅纓子糯高粱，采用“三高三長”醬酒釀制工藝，所釀酒體醬香突出，幽雅細(xì)膩，深受業(yè)界及消費者好評。目前，鮮有關(guān)于我公司南洲大曲的研究報道。

基于此，本研究運用高通量測序技術(shù)檢測南洲大曲和茅臺大曲的細(xì)菌多樣性，采用生物信息學(xué)分析方法對比研究南洲大曲與茅臺大曲之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。通過本研究為我公司醬香型大曲工藝的改良以及產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

耗材：本實驗所用高溫大曲為南洲大曲以及茅臺大曲，由湖南南洲酒業(yè)有限公司提供。大曲微生物DNA試劑盒為Fast DNA?Spin Kit for Soil。

儀器：Illumina MiSeq 高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲微生物DNA的提取

采用Fast DNA? Spin Kit for Soil 試劑盒提取兩種大曲的總DNA，具體提取步驟參照試劑盒說明書。提取后的DNA 采用Nanodrop 進(jìn)行定量，并通過1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。檢測合格的樣品使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。細(xì)菌使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增V4 高變區(qū)。本測試在中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院高通量測序平臺完成。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

在序列充足的情況下，為了使分析結(jié)果質(zhì)量更高，首先對測序得到的原始數(shù)據(jù)（Raw Data）進(jìn)行過濾處理，得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data），基于有效數(shù)據(jù)進(jìn) 行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚 類分析?；贠TU 聚類結(jié)果，可對OTU 進(jìn)行Alpha 多樣性分析，了解樣品內(nèi)微生物群落的多樣性和豐富度?；谖锓N組成分析，得到相應(yīng)的物種信息；Venn圖分析得到樣品間共有或獨有的物種數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種高溫大曲細(xì)菌群落Alpha 多樣性比較分析

通過質(zhì)量初篩的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體后的樣品的高質(zhì)量序列量分別為茅臺大曲68679、南洲大曲67202?；诩?xì)菌OTU 數(shù)進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)分析以及豐度等級曲線分析如表1、圖1 所示。從表1 可以看出，兩個高溫大曲樣品的覆蓋率（Goods coverage）均高于0.99，說明測序結(jié)果具有較高可信度，能夠反映樣品的真實情況。

圖1 豐度等級曲線圖

一般，多樣性指數(shù)主要反映樣品內(nèi)微生物群落的多樣性和豐富度。其中，Chao1 指數(shù)和Observed species 指數(shù)標(biāo)示樣品細(xì)菌群落的豐富度，Chao1 指數(shù)和Observed species 指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。茅臺大曲的Chao1 指數(shù)和Ob-served species 指數(shù)分別為432.61、428.80，均高于南洲大曲（Chao1 指數(shù)421.28，Observed species 指數(shù)420.60），說明茅臺大曲樣品的細(xì)菌群落豐富度高（表1）。Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)用來反映樣品的物種多樣性，Shannon 指數(shù)/Simpson 指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。就樣品的細(xì)菌多樣性來說，南洲大曲樣品的Simpson 指數(shù)（0.96）以及Shannon 指數(shù)（5.93）較高，表明南洲大曲樣品中細(xì)菌多樣性高。Pielou’s evenness 指數(shù)標(biāo)示微生物群落的均勻性，南洲大曲樣品的細(xì)菌群落均勻性略高于茅臺大曲。

表1 兩種高溫大曲細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)比較分析結(jié)果

圖1 為兩個樣品的豐度等級曲線圖，該曲線可以直觀地反映群落中高豐度和稀有OTU 的數(shù)量。折線在橫軸上的長度反映了樣品在該豐度中的OTU 數(shù)；折線的平緩程度，反映了群落組成的均勻度，折線越平緩，則群落中各OTU 間的豐度差異越小，群落組成的均勻度越高，折線越陡峭，則均勻度越低。從圖1 可知，兩個高溫大曲樣品微生物群落組成均勻。

2.2 兩種大曲之間物種差異性分析

韋恩圖可以直觀反映不同樣品之間的共有物種和特有物種，茅臺大曲和南洲大曲兩個樣品的微生物物種差異性如圖2 所示。從圖2 可知，茅臺大曲和南洲大曲的細(xì)菌數(shù)分別為430、419，兩個高溫大曲之間共有的細(xì)菌數(shù)僅為86 個，說明兩者之間的細(xì)菌群落差異性較大，這可能與兩種大曲制曲的環(huán)境、氣候不同相關(guān)。

圖2 兩種高溫大曲的韋恩圖

2.3 兩種大曲之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較分析

2.3.1 兩種大曲的細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步比較兩種大曲之間細(xì)菌群落豐度上的差異，根據(jù)OTU 分析結(jié)果，對樣品數(shù)據(jù)在門和屬水平上進(jìn)行分類學(xué)分析。選取在門水平上豐度排名前20 的微生物進(jìn)行差異性分析，結(jié)果見圖3。從圖3 可知，茅臺大曲和南洲大曲中的優(yōu)勢菌門均為Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）以及Cyanobacteria（藍(lán)藻菌門）。這與前人研究結(jié)果相似，趙馳等發(fā)現(xiàn)不同原料制成的高溫大曲均是以厚壁菌門和放線菌門為絕對優(yōu)勢門；侯強(qiáng)川等發(fā)現(xiàn)湖北省堯治河高溫大曲以厚壁菌門、放線菌門、變形菌門作為優(yōu)勢菌門；戴奕杰等發(fā)現(xiàn)醬香型白酒在高溫制曲、發(fā)酵釀酒兩個階段的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門4類。說明醬香型白酒的優(yōu)勢菌門以上述4 類為主，但不同菌門的豐度不一致。本研究中南洲大曲和茅臺大曲就4 類優(yōu)勢菌門而言，細(xì)菌的群落豐度存在差異。南洲大曲的放線菌門（8.36 %）豐度顯著低于茅臺大曲的放線菌門豐度（23.62 %），變形菌門豐度（30.66%）顯著高于茅臺大曲的變形菌門豐度（14.22%）。

圖3 基于門水平兩種高溫大曲的細(xì)菌相對豐度圖

2.3.2 兩種大曲的細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平兩種大曲的細(xì)菌相對豐度圖如圖4所示。相對豐度較高的菌屬為（芽孢桿菌屬）、（乳球菌屬）、（糖多孢菌屬）、（克羅彭斯特菌屬）、（假諾卡氏菌屬）、（片球菌屬）、（魏斯氏菌屬）、（高溫放線菌屬）等。本文研究與前人研究結(jié)果相似，GAN等分析茅臺大曲的微生物群落組成和功能特征，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群為鏈孢桿菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、乳酸菌屬（）、糖多孢菌屬（）和枝芽孢菌屬（）等；JIANG 等采用高通量測序技術(shù)解析北方醬香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物多樣性，結(jié)果表明，6 個大曲樣品中主要細(xì)菌屬為乳酸菌（）、魏斯氏菌（）、芽孢桿菌（）、糖多孢菌（）等。從圖4 來看，（芽孢桿菌屬）在南洲大曲和茅臺大曲中是絕對優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為24.03%、22.96%。研究表明，芽孢桿菌屬是醬香型白酒中的功能微生物，具有較強(qiáng)的酶分泌能力，能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、糖化酶等，還能生成醬香型白酒中的風(fēng)味成分，如四甲基吡嗪等。在茅臺酒曲中為優(yōu)勢菌屬的（乳球菌屬）19.13 %、（克羅彭斯特菌屬）7.00 %，在南洲大曲中的相對豐度僅為2.15 %和1.57 %。相反地，南洲大曲中相對豐度較高的（片球菌屬）9.18%、（魏斯氏菌屬）8.26%、（沙雷氏菌屬）4.54 %、（高溫放線菌屬）4.54 %等幾個菌屬在茅臺大曲中相對豐度較低，僅為0.85 %、0.20 %、0.27 %、0.15 %。上述結(jié)果顯示兩種大曲之間在細(xì)菌屬水平上存在較大差異，南洲大曲存在獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)。有報道顯示，克羅彭斯特菌屬在白酒發(fā)酵中有利于乙酸、乳酸、乙酸乙酯等風(fēng)味的形成。魏斯氏菌屬作為乳酸菌的一類，具有生成乳酸，降低發(fā)酵體系pH 值的作用，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)是至關(guān)重要的菌株。因此，通過對比茅臺大曲和南洲大曲細(xì)菌屬的差異，可為后續(xù)南洲大曲酒廠篩選功能微生物或強(qiáng)化大曲提供一定指導(dǎo)。

圖4 基于屬水平兩種高溫大曲的細(xì)菌相對豐度圖

3 結(jié)論

本研究采取高通量測序技術(shù)，以茅臺大曲為標(biāo)尺對比分析了南洲大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。結(jié)果表明，Alpha多樣性指數(shù)中，茅臺大曲的細(xì)菌群落豐富度較高，南洲大曲的細(xì)菌群落多樣性較高。在細(xì)菌門水平，茅臺大曲和南洲大曲中的優(yōu)勢菌門均為Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）以及Cyanobacteria（藍(lán)藻菌門）。南洲大曲的放線菌門（8.36 %）豐度顯著低于茅臺大曲的放線菌門豐度（23.62 %），變形菌門豐度（30.66 %）顯著高于茅臺大曲的變形菌門豐度（14.22%）；細(xì)菌屬水平，南洲大曲和茅臺大曲的絕對優(yōu)勢菌屬均為（芽孢桿菌屬），但兩種大曲之間在細(xì)菌屬水平上存在較大差異，南洲大曲存在獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢菌屬為（芽孢桿菌屬）、（片球菌屬）、（魏斯氏菌屬）、（沙雷氏菌屬）等。通過對比分析南洲大曲與茅臺大曲之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異，可為后續(xù)醬香型大曲工藝的改良以及產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供有益指導(dǎo)。