陳德坤，鄒振興*（1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長沙 410013；2.慢病診療小分子藥物發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410013）

植物內(nèi)生菌是指存活于健康宿主植物組織器官內(nèi)，不會引起直接、明顯的致病癥狀的一類特殊的微生物類群。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)的次級代謝產(chǎn)物約有51%為新型化合物，高于土壤微生物（38%），且內(nèi)生菌中次級代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，如抗菌、抗腫瘤等，具有潛在的藥用價值。目前，內(nèi)生菌研究熱點(diǎn)主要為細(xì)菌與真菌，其中植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物研究已成為發(fā)現(xiàn)新型活性化合物的重要途徑。

落葵薯

Anredera cordifolia

是落葵科藤本植物，作為一味藥食同源的新興保健蔬菜，不僅具有較好的營養(yǎng)保健價值，還具有降壓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等功效。近年落葵薯的研究主要集中在植物化學(xué)與藥理作用，而關(guān)于其內(nèi)生真菌鮮有報(bào)道。課題組前期從落葵薯珠芽部分離純化得到一株內(nèi)生真菌，并經(jīng)ITS 鑒定菌種為

Fusarium graminearum

TSQ-2，采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)，從其次級代謝產(chǎn)物中得到了5 個化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析，分別鑒定結(jié)構(gòu)為zearalenone（1）、clavatustide C（2）、W493 C（3）、4，4，24-trimethyl cholesta-8，14，24（28）-trien-2

α

，3

β

，11

α

，12

β

，tetrol 12-acetate（4）、glycerolmonopalmitate（5），并對其腫瘤細(xì)胞毒活性和抗菌活性進(jìn)行評價。

1 材料

液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（液相色譜儀型號：Agilent 1290；質(zhì)譜儀型號：Agilent 6500 series Q-TOF），核磁共振儀（型號：Burker AVANCE Ⅲ 500M， 瑞士Burker 公司）；電子分析天平（型號：SQP，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（美國GE 公司）；半制備液相色譜儀（型號：安捷倫1100，安捷倫科技有限公司）；ODS 反相C填料（日本YMC 公司）；柱色譜硅膠（80 ～100 目、200 ～300 目）；大孔樹脂（HPD-100 型大孔吸附樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；薄層色譜用硅膠G（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；半制備色譜柱（型號：Innoval ODS-2，5 μm，10 mm×250 mm）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號：EYELA N N-1100S-W）；所用試劑均為分析純。

落葵薯植株于2019年7月采自湖南省永州市江華湘江鄉(xiāng)廟子源村，經(jīng)中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院徐康平副教授鑒定為落葵科落葵薯屬植物落葵薯（

Anredera cordifolia

）的珠芽。該實(shí)驗(yàn)菌株分離自落葵薯珠芽，委托擎科生物有限公司進(jìn)行ITS測序，NCBI 數(shù)據(jù)庫blast 比對，鑒定為禾谷鐮刀菌（

Fusarium graminearum

TSQ-2），GenBank 登錄號為No.SUYEP0UP015。目前菌種保存于中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌株發(fā)酵

將目標(biāo)菌株植入液體培養(yǎng)基，恒溫?fù)u床搖蕩7 d（180 r·min，28℃）作種子液，倒入20 瓶裝有固體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中（每瓶加入250 g 大米，250 g 超純水，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min），于28℃恒溫下靜置培養(yǎng)28 d。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

目標(biāo)菌株培養(yǎng)于5 kg 固體培養(yǎng)基28 d 后，用乙酸乙酯將固體發(fā)酵物冷浸提取3 次，每次1 d，合并提取液減壓濃縮得到總浸膏78 g。浸膏采取大孔樹脂柱層析依次以20%乙醇、80%乙醇和100%乙醇洗脫得到3 個組分。80%乙醇洗脫部位（21.0 g）經(jīng)硅膠柱層析（200 ～300 目），依次采取石油醚-乙酸乙酯（100∶0 ～1∶1）及氯仿-甲醇（100∶1 ～1∶1）梯度洗脫得到8 個組分（Fr.1 ～Fr.8）。Fr.2 經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-二氯甲烷（100∶1 ～0∶100）梯度洗脫得到Fr.2-1 與Fr.2-2，將Fr.2-1 經(jīng)凝膠柱色譜分離得到Fr.2-1-1 和Fr.2-1-2，F(xiàn)r.2-1-1 經(jīng)半制備高效液相色譜（80%～95%乙腈洗脫25 min，3 mL·min）分離純化得到化合物1（4.8 mg）和化合物4（8.1 mg）；Fr.3 經(jīng)反相色譜柱，以甲醇-水（20∶80 ～100∶0）梯度洗脫得到Fr.3-1 和Fr.3-2，F(xiàn)r.3-2 經(jīng)半制備高效液相（60%～80%乙腈洗脫30 min，3 mL·min）分離純化得到化合物2（2.6 mg）和化合物5（2.1 mg）；Fr.5 經(jīng)硅膠色譜柱，以二氯甲烷-甲醇（100∶1 ～1∶1）梯度洗脫，得到4 個組分，其中Fr.5-4 經(jīng)半制備高效液相（40%～75%乙腈洗脫30 min，3 mL·min）分離純化得到化合物3（6.2 mg），結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1 ～5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Chemical structures of compounds 1 ～5

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色粉末（甲醇），HR-EI-MS顯示

m/z

321.1713 [M ＋H]，推測分子式為CHO；H-NMR（500 MHz，MeOD）

δ

：1.34（3H，d，

J

＝6.0 Hz，H-11'），3.71（1H，t，

J

＝9.0 Hz，H-6'），5.95（1H，m，H-2'），6.20（1H，d，

J

＝2.5 Hz，H-3），6.44（1H，d，

J

＝2.5 Hz，H-5），6.71（1H，d，

J

＝15.5 Hz，H-1'）；C-NMR（125 MHz，MeOD）

δ

：19.2（C-11'），20.4（C-8''），23.7（C-4'），32.1（C-3'），32.7（C-5'），35.7（C-9'），37.2（C-7'），69.6（C-6'），74.2（C-10'），102.6（C-3），107.8（C-1，C-5），132.3（C-1'），133.2（C-2'），142.6（C-6），162.8（C-2），163.3（C-4），172.3（C-12'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故化合物1 鑒定為zearalenone?；衔?：白色粉末（甲醇），HR-EI-MS 顯示

m/z

566.4241 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.81（3H，m，H-12），7.35（1H，d，

J

＝6 Hz，H-28），7.90（1H，d，

J

＝8.4 Hz，H-35），8.27（1H，d，

J

＝9.0 Hz，H-7），8.39（1H，d，

J

＝7.2 Hz，H-14），8.67（1H，d，

J

＝6 Hz，H-21）；C-NMR（150 MHz，DMSO-

d

）

δ

：10.4（C-12），11.8（C-5），15.9（C-13），16.1（C-6），22.3（C-20），22.7（C-34），22.8（C-19），22.9（C-33），23.2（C-26），24.7（C-25），24.7（C-4），25.1（C-18），25.1（C-32），33.7（C-10），35.9（C-3），39.3（C-31），40.5（C-17），42.0（C-24），50.8（C-30），52.5（C-16），58.8（C-2），63.3（C-9），170.7（C-1），171.6（C-15），171.8（C-22），172.6（C-29），173.1（C-8），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故化合物2 鑒定為clavatustide C?；衔?：白色粉末（甲醇），HR-EI-MS顯示

m/z

888.5485 [M ＋H]， 推測分子式為CHNO。H-NMR（400 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.76（3H，t，

J

＝5.0 Hz，H-6），0.79（3H，d，

J

＝5.0 Hz，H-4），0.86（3H，t，

J

＝7.5 Hz，H-45），1.02（2H，m，H-5），1.13（3H，d，

J

＝5.0 Hz，H-30），3.80（1H，t，

J

＝7.5 Hz，H-2），3.90（1H，d，

J

＝10.0 Hz，H-29），3.97（1H，m，H-17），4.05（1H，m，H-25），4.49（1H，m，H-8），4.83（1H，m，H-33）；C-NMR（100 MHz，DMSO-

d

）

δ

：10.4（C-6），14.0（C-45），15.2（C-4），15.3（C-35），17.3（C-26），17.7（C-23），20.3（C-3），22.1 ～37.6（C-3/5/9/18/19/34，36 ～44），49.1（C-25），49.7（C-22），52.9（C-17），54.0（C-8），57.6（C-2），58.9（C-28），66.6（C-29），75.1（C-33），114.9（C-13），127.4（C-10），130.2（C-11/15），155.9（C-12/14），168.4（C-31），170.4（C-27），171.0（C-16），171.2（C-1），172.2（C-21），172.4（C-7），173.1（C-24），173.7（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故化合物3 鑒定為W493 C?；衔?：白色粉末（二氯甲烷），HR-EIMS 顯示

m/z

519.3452 [M ＋Na]，H-NMR（400 MHz，CDCl）

δ

：0.86（3H，s，H-29），1.08（3H，s，H-30），1.02（6H，s，H-26/27），1.08（3H，s，H-18），1.25（3H，s，H-19），3.26（1H，m，H-3），4.27（1H，s，H-11），4.70（2H，d，

J

＝30.0 Hz，H-28），4.98（1H，s，H-12），5.61（1H，s，H-15）；C-NMR（100 MHz，DMSO-

d

）

δ

：15.5（C-29），16.9（C-18），18.0（C-6），18.2（C-21），21.3（C-32），21.9（C-26），22.0（C-27），22.3（C-19），27.1（C-7），27.5（C-2），28.2（C-30），30.9（C-23），33.3（C-20），33.8（C-22），34.4（C-25），35.0（C-1），35.3（C-16），37.3（C-10），39.2（C-4），46.5（C-13），49.1（C-17），50.2（C-5），69.0（C-11），78.9（C-12），79.0（C-3），106.1（C-28），121.4（C-15），126.1（C-8），138.4（C-9），146.8（C-14），156.6（C-24），171.0（C-31）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，鑒定化合物4 為4，4，24-trimethyl cholesta-8，14，24（28）-trien-2

α

，3

β

，11

α

，12

β

，tetrol 12-acetate?；衔?：淡黃色油狀物（二氯甲烷），HREI-MS 顯示

m/z

331.2846 [M ＋H]，推測分子式為CHO。H-NMR（600 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.85（3H，t，

J

＝18 Hz，H-16），1.26（24H，H-4 ～15），2.28（2H，t，

J

＝6.0 Hz，H-2'）；C-NMR（150 MHz，DMSO-

d

）

δ

：14.4（C-16），22.6（C-15），24.9（C-14），28.9（C-13），29.2（C-12），29.4（C-11），29.5（C-4 ～10），31.8（C-3），34.0（C-2），63.1（C-2'），66.0（C-4'），69.8（C-3'），173.4（C-1）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故化合物5 鑒定為glycerolmonopalmitate。

2.4 生物活性評價

將兩株肝癌干細(xì)胞（SMMC7721 和HepG2）在含10%胎牛血清和100 U·mL青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中、37℃下培養(yǎng)。將初始濃度為1×10個細(xì)胞·mL的懸液（100 μL）接種到96 孔板中，置于37℃、5%CO條件下孵育24 h。再用濃度范圍為1.25 ～80 μmol·L的目標(biāo)化合物1 ～5 和1.25 ～80 μmol·L的陽性對照藥索拉非尼處理細(xì)胞。繼續(xù)培育48 h 后，每孔加入50 μL MTT（2 mg·mL）反應(yīng)4 h 后加入200 μL DMSO 溶解甲臜結(jié)晶，在450 nm 處測定吸光度值（

OD

），所有結(jié)果均平行測定3 次，取平均值。計(jì)算化合物對腫瘤細(xì)胞的生長抑制率：抑制率（%）＝[1 －（

OD

－

OD

）/（

OD

－

OD

）]×100%，結(jié)果顯示僅化合物4 對SMMC7721、HepG2 細(xì)胞的增殖具有抑制活性，

IC

值分別為（23.1±1.84）和（24.2±2.16）μmol·L，陽性對照組索拉非尼的

IC

值分別為（2.19±0.04）和（4.80±0.08）μmol·L。同時還利用96 孔板稀釋法評估了化合物1 ～5 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和大腸埃希菌（

E.coil

）的抑制作用，結(jié)果顯示化合物1 ～5在最大濃度500 μg·mL下均未顯示抑菌活性。

3 討論

植物內(nèi)生菌是一個巨大的微生物資源庫，藥用植物內(nèi)生真菌作為一類特殊的微生物群體，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的活性次級代謝產(chǎn)物，其中相當(dāng)一部分具有抗腫瘤活性，其結(jié)構(gòu)類型包括生物堿、萜類、甾體、聚酮類、脂肪酸類等，表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值，因此從藥用植物中分離內(nèi)生菌并對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究已成為天然藥物化學(xué)研究的熱點(diǎn)。本研究首次對落葵薯植物內(nèi)生菌進(jìn)行研究，并從中分離得到兩個環(huán)五肽（1 ～2），一個三萜（3）以及一個二羥基苯酸內(nèi)酯（4）和一個長鏈脂肪酸（5）。本研究報(bào)道的化合物2 和5為首次從

Fusarium

屬菌中分離獲得。在體外抗腫瘤活性測試結(jié)果顯示，化合物4 對SMMC-7721和HepG2 細(xì)胞的增殖有中等抑制活性。本研究填補(bǔ)了落葵薯內(nèi)生真菌化學(xué)成分研究領(lǐng)域的空白，豐富了落葵薯內(nèi)生真菌資源多樣性，在一定程度上豐富了真菌

Fusarium graminearum

次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分和生物活性，為禾谷鐮刀菌次生代謝產(chǎn)物的利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。