牛若惠，常占瑛，熱娜·吉恩斯，高曉黎，2*（.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 8300；2.新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 8300）

石榴（

Punica granatum

L.）是石榴科石榴屬植物。石榴皮為石榴的干燥果皮。研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮中富含多酚類、生物堿類、黃酮類、氨基酸和有機(jī)酸等化學(xué)物質(zhì)，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲等功效。石榴皮具有安全可靠、多功能、天然等優(yōu)點(diǎn)。石榴皮多酚有很強(qiáng)的抗氧化活性，可用于預(yù)防和治療多種疾病如炎癥、糖尿病和心腦血管疾病等。安石榴苷（punicalagin）為石榴皮多酚的主要成分，其含量在10%左右。因其結(jié)構(gòu)中含有較多羥基，也具有很強(qiáng)的抗氧化活性。研究表明，安石榴苷還對癌癥、炎癥、病毒、糖尿病等有一定的治療效果，其可以抑制脂肪酸合成酶的活性，因此對肥胖也有一定的防治作用。此外，其還在多種慢性疾病如心血管疾病和肝臟疾病中發(fā)揮著積極的作用。目前，安石榴苷的純化方法有柱色譜分離，如大孔吸附樹脂、凝膠LH-20 色譜、MCI-gel CHP-20P、高速逆流色譜法、制備型高效液相色譜法等。膜分離技術(shù)是一種全新的高效分離、濃縮、提純的技術(shù)，其具有效率高、運(yùn)行穩(wěn)定及成本低等特性，近年來在中藥制藥領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)擬在課題組已獲得安石榴苷純化技術(shù)專利的基礎(chǔ)上，優(yōu)化洗脫條件，并使用膜分離技術(shù)進(jìn)行濃縮，進(jìn)一步優(yōu)化安石榴苷的純化工藝，建立簡便、高效的純化方法，以提高安石榴苷的轉(zhuǎn)移率及純度。并對制備得到的安石榴苷精制物進(jìn)行穩(wěn)定性考察，為其存儲提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

安石榴苷粗品（試驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC 測定含量為45%）；安石榴苷對照品（純度大于98.82%，批號：MUST-20050502）、鞣花酸對照品（純度大于 99.65%，批號：MUST-17052603）、安石榴林對照品（純度大于99.37%，批號：MUST-16030105）（成都曼斯特生物科技有限公司）；HPD500 型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；95%乙醇（食用酒精）；甲醇（色譜純，美國Sigma 公司）；三氟乙酸（Macklin）；氫氧化鈉（NaOH，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）；鹽酸（洛陽市化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器

LC-20AT LC-20AB 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB135-S 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；PB-10 型pH 計(jì)（北京賽多利斯公司）；ZXMP-AL230 恒溫恒濕箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；ZS51213340 藥品強(qiáng)光穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（偵翔環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備）；FH-UF/NF-2 型復(fù)合型納濾濃縮裝置（江蘇凱米膜科技股份有限公司）；R-2003 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮裝置（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 安石榴苷HPLC 方法學(xué)驗(yàn)證及含量測定

2.1.1 色譜條件 根據(jù)課題組前期建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜法測定。色譜柱：Agilent SB-C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 ～15 min：97%A；15 ～25 min：80%A；25 ～35 min：55%A；35 ～40 min：35%A）；檢測波長370 nm；流速1 mL·min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。

2.1.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取安石榴苷、安石榴林、鞣花酸對照品6.5、5、5 mg 于10 mL 的棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為650、500、500 μg·mL的對照品儲備液，備用（臨用時(shí)稀釋至所需質(zhì)量濃度）。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密稱取安石榴苷精制物25 mg 于25 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，即得供試品溶液，備用。

2.1.4 方法學(xué)考察 分別取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測，記錄峰面積，對方法的專屬性、線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率進(jìn)行考察。色譜圖見圖1，安石榴苷峰形良好，樣品的保留時(shí)間與對照品的保留時(shí)間一致，溶劑不產(chǎn)生干擾。安石榴苷在40.625 ～650 μg·mL與峰面積具有良好的線性關(guān)系（

A

＝5654.6

C

＋7725.5，

R

＝0.9999）。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的

RSD

值均小于2.0%，符合方法學(xué)要求。樣品的平均回收率為99.75%（

n

＝6），

RSD

為2.8%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

圖1 安石榴苷色譜圖Fig 1 Chromatogram of punicalagin

2.1.5 樣品含量測定 精密稱取安石榴苷精制物25 mg 于25 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，精密量取2 mL 至10 mL 量瓶，甲醇定容至刻度混勻后，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算含量。

2.2 精制工藝的優(yōu)化

2.2.1 上樣液制備 根據(jù)課題組前期建立的純化工藝，采用HPD500 型大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，取安石榴苷粗品，用水配制成安石榴苷質(zhì)量濃度為1.3 mg·mL的溶液（相當(dāng)于石榴皮生藥濃度20.8 mg·mL），用HCl 調(diào)pH 至2，過濾，取濾液即得上樣液。

2.2.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取HPD500 型大孔吸附樹脂適量，95%乙醇溶液浸泡24 h 進(jìn)行活化，將活化后的樹脂投入玻璃柱內(nèi)，用95%乙醇溶液沖洗樹脂，洗凈至與純化水1∶5 混合不呈白色混濁，再用純化水洗至流出液不含酒精（用酒精計(jì)測量），放置，備用。

2.2.3 上樣吸附工藝條件 取pH 值為2、安石榴苷質(zhì)量濃度為1.3 mg·mL的溶液5 BV，加到已預(yù)處理好的HPD500 型樹脂柱上，以2 BV·h的動(dòng)態(tài)吸附速度上樣，靜態(tài)吸附12 h 后，開始洗脫。

2.2.4 計(jì)算公式

式中：

T

，安石榴苷轉(zhuǎn)移率（%）；

C

，安石榴苷的含量（%）；

Y

，安石榴苷收率（%）；

L

，安石榴苷損失率（%）；

m

，上樣液中安石榴苷的質(zhì)量（mg）；

m

，洗脫液中安石榴苷的質(zhì)量（mg）；

m

，上樣液流分中安石榴苷的質(zhì)量（mg）；

m

，除雜洗脫液中安石榴苷的質(zhì)量（mg）；

m

，安石榴苷精制物的質(zhì)量（mg）；

m

，剩余安石榴苷的質(zhì)量（mg）。除雜率（%）是將雜質(zhì)（保留時(shí)間為11.619 min 的安石榴林及保留時(shí)間在12.76 ～13.264 min 內(nèi)的未知成分）的峰面積代入安石榴苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其質(zhì)量，以洗脫液中雜質(zhì)的質(zhì)量/上樣液中雜質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算。

2.2.5 單因素考察 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備上樣液，根據(jù)“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行上樣吸附后，以4 BV·h的流速進(jìn)行洗脫，分別考察除雜溶劑（水、5%乙醇、8%乙醇、10%乙醇）、除雜溶劑洗脫終點(diǎn)（1、2、3、4、5、6、7、8 BV）、洗脫劑中NaOH 的濃度（0%、0.001%、0.0025%、0.005%、0.01%、0.015%）、乙醇濃度（0%、5%、10%、15%、20%、25%）、 洗脫溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃）、洗脫劑用量（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 BV）對安石榴苷含量的影響。將各洗脫液進(jìn)HPLC 分析，測定安石榴苷的含量。

除雜溶劑及除雜劑洗脫終點(diǎn)的試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，隨著洗脫劑中乙醇濃度增大，除雜率與安石榴苷的損失率均逐漸增大，在保證安石榴苷盡可能少的損失下，8%乙醇除雜率最高，因此確定使用8%乙醇作為除雜洗脫液。8%乙醇洗脫柱體積達(dá)到6 BV 時(shí)，安石榴苷的含量開始呈線性增長趨勢（見圖2A），為了避免損失大量的安石榴苷，確定8%乙醇洗脫終點(diǎn)為6 BV。

表1 除雜溶劑的影響
Tab 1 Effect of impurity removal solvents

除雜溶劑除雜率/%安石榴苷損失率/%水25.01 0.28 5%乙醇36.23 0.68 8%乙醇47.08 3.56 10%乙醇53.2315.10

氫氧化鈉濃度的影響如圖2B 所示，在氫氧化鈉的濃度為0%～0.015%內(nèi)，洗脫液中安石榴苷的含量隨著NaOH 濃度的增加出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在NaOH 濃度為0.01%時(shí)，洗脫液中安石榴苷的含量最高。安石榴苷呈弱酸性，在酸性條件下容易被大孔吸附樹脂吸附，堿性條件有利于洗脫，因此確定洗脫劑中加入氫氧化鈉的濃度為0.01%。

乙醇濃度的影響如圖2C 所示，安石榴苷具有很強(qiáng)的極性，當(dāng)以水作為洗脫劑時(shí)，洗脫液中安石榴苷的含量最高。隨著乙醇濃度的增加，一些極性較小的成分會(huì)隨著安石榴苷一同洗脫，含量逐漸降低。因此確定以含0.01%氫氧化鈉的純化水作為洗脫溶劑。

洗脫溫度的影響如圖2D 所示，在洗脫溫度20 ～45℃內(nèi)，洗脫液中安石榴苷的含量差異不大?？紤]到安石榴苷屬于多酚類物質(zhì)，對熱敏感，為了保證洗脫過程中安石榴苷的穩(wěn)定性以及工藝的簡便性，因此確定于室溫條件下進(jìn)行洗脫。

洗脫劑用量的影響如圖2E 所示，在洗脫過程中發(fā)現(xiàn)，使用含0.01%NaOH 的純化水于室溫洗脫2 BV 后，樹脂柱上黃色條帶到達(dá)最底端，此時(shí)開始接收的洗脫液中安石榴苷含量最高，自此再洗脫3 BV 后，安石榴苷的含量開始呈下降趨勢。為了得到高純度的安石榴苷精制物，確定使用含0.01%NaOH 水洗至黃色條帶到達(dá)柱底后，再收集3 BV 作為洗脫流分。

圖2 除雜溶劑洗脫終點(diǎn)（A）、氫氧化鈉濃度（B）、乙醇濃度（C）、洗脫溫度（D）、洗脫劑用量（E）對安石榴苷含量的影響Fig 2 Effects of impurity removal solvent elution end point（A），sodium hydroxide concentration（B），ethanol concentration（C），elution temperature（D）and eluent dosage（E）on the content of punicalagin

2.2.6 濃縮工藝比較 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果篩選的最優(yōu)洗脫條件進(jìn)行試驗(yàn)，收集安石榴苷洗脫液流分，分成2 份，分別以減壓濃縮和膜分離（200 D 納濾膜）兩種方式進(jìn)行濃縮。濃縮液經(jīng)冷凍干燥得安石榴苷精制物，按照“2.1.5”項(xiàng)下方法測定精制物中安石榴苷含量。

減壓濃縮和納濾濃縮過程參數(shù)和結(jié)果如表2所示，安石榴苷對熱敏感，在減壓濃縮時(shí)溫度需控制在45 ℃以內(nèi)，但由于該工藝中洗脫劑為水，在使用減壓濃縮除水時(shí)其濃縮效率僅20%，使用膜分離技術(shù)納濾膜濃縮可在室溫條件下進(jìn)行，濃縮效率高，得到的精制物中安石榴苷的含量較減壓濃縮的高，因此選用分子量為200 D 的納濾膜對洗脫液進(jìn)行濃縮。

表2 減壓濃縮和納濾濃縮對比結(jié)果
Tab 2 Vacuum concentration and nanofiltration concentration

濃縮方式濃縮過程參數(shù)樣品量/L所用時(shí)間/h濃縮后體積/L濃縮效率/%安石榴苷的含量/%溫度/℃壓力/MPa減壓濃縮45＜－0.0810282084.14納濾濃縮室溫5 ～720157586.76

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證試驗(yàn)所采用的最優(yōu)洗脫工藝為：上樣液靜置12 h 后，先用6 BV8%乙醇溶液除雜后，再用含0.01%NaOH 的純化水于室溫條件下洗脫至黃色條帶到達(dá)柱底后，開始接收3 BV 流分，流速為4 BV·h。使用分子量為200 D 的納濾膜對安石榴苷流分進(jìn)行濃縮，濃縮液冷凍干燥得安石榴苷精制物。

3 次精制試驗(yàn)所獲安石榴苷的平均轉(zhuǎn)移率為72.70%，

RSD

為2.6%（

n

＝3）；安石榴苷的平均收率為69.66%，

RSD

為1.3%（

n

＝3）；安石榴苷的平均百分含量為84.56%，

RSD

為1.6%（

n

＝3）；平均損失率為25.61%，表明精制工藝穩(wěn)定可行。

2.4 安石榴苷精制物中未知組分的初步鑒定

精密稱取安石榴苷精制物25 mg 于25 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，用0.22 μm 濾膜過濾，另取“2.1.2”項(xiàng)下的安石榴林及鞣花酸對照品儲備液各1 mL 于10 mL 量瓶中，定容混勻后，用0.22 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3 所示。通過與對照品比對，確定峰2 為安石榴林，峰10 為鞣花酸。

圖3 安石榴苷精制物HPLC 圖譜Fig 3 HPLC of punicalagin refined product

2.5 安石榴苷精制物穩(wěn)定性的影響因素研究

2.5.1 高溫 精密稱取安石榴苷精制物適量，置于敞口的稱量瓶中放在藥物穩(wěn)定性檢查儀中（60 ℃），于0、5、10 d 取樣，觀察其外觀性狀、增減質(zhì)量并測定安石榴苷的含量。并對0、5、10 d 時(shí)安石榴苷精制物中各組分進(jìn)行定量分析。

安石榴苷精制物在60 ℃條件下放置5 d 后，減重4.62%，含量降低了9.0%，結(jié)果見表3。安石榴苷結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，高溫條件加速其被氧化而降解。精制物中除安石榴苷、安石榴林及鞣花酸外，還含6 種未知成分，通過面積歸一化法發(fā)現(xiàn)精制物在高溫60 ℃條件下放置10 d，安石榴苷的含量逐漸降低，安石榴林、鞣花酸、峰1 和峰4 這4 種成分含量增加，其中，安石榴林及鞣花酸為主要的降解產(chǎn)物。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。故安石榴苷精制物需在低溫條件下保存。

表3 高溫試驗(yàn)結(jié)果
Tab 3 High temperature test

取樣時(shí)間/d外觀性狀質(zhì)量變化 /% 含量測定 /%精制物中各組分面積占比/%峰1峰2（安石榴林）峰3峰4峰5峰6、7（安石榴苷）峰8峰9峰10（鞣花酸）總0棕黃色疏松粉末085.18±1.39 0.771.781.530.490.2893.360.290.550.95100.0 5棕黃色疏松粉末 －4.62±0.05 77.50±1.10 1.232.551.740.940.3390.350.230.592.04100.0 10棕黃色疏松粉末 －5.14±0.15 76.10±1.67 1.373.281.711.020.3588.650.290.592.69100.0

2.5.2 高濕 精密稱取安石榴苷精制物適量，置于敞口的稱量瓶中放在恒溫恒濕箱中[相對濕度（75±5）%，25 ℃]，密閉保存，于0、5、10 d取樣，觀察其外觀性狀、增減質(zhì)量并測定安石榴苷的含量。

安石榴苷精制物在相對濕度（75±5）%的條件下放置5 d 吸濕增重高達(dá)13.19%，但其含量未發(fā)生明顯變化，結(jié)果見表4。由于安石榴苷具有很強(qiáng)的吸濕性，應(yīng)將安石榴苷精制物置于干燥環(huán)境中密封保存。

表4 高濕試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 High humidity test

取樣時(shí)間/d外觀性狀質(zhì)量變化/%含量測定/%0棕黃色疏松粉末085.18±1.39 5棕黃色粘連粉末13.19±0.2085.40±0.92 10棕黃色粘連粉末13.00±0.2885.87±0.99

2.5.3 強(qiáng)光照射 精密稱取安石榴苷精制物適量，置于敞口的稱量瓶中于澄明度檢測儀（4500±500）lx 下照射，于0、5、10 d 取樣，觀察其外觀性狀、增減質(zhì)量并測定安石榴苷的含量。

安石榴苷精制物在25℃，（4500±500）lx 的強(qiáng)光照射下放置5 d，表層粉末出現(xiàn)粘連，增重2.86%，含量下降了1.7%，結(jié)果見表5，表明安石榴苷對光敏感，應(yīng)注意避光貯藏。

表5 強(qiáng)光照射試驗(yàn)結(jié)果
Tab 5 Strong light exposure test

取樣時(shí)間/d外觀性狀質(zhì)量變化/%含量測定/%0棕黃色疏松粉末085.18±1.39 5棕黃色表面粘連粉末2.86±0.0583.69±0.89 10棕黃色表面粘連粉末2.92±0.0982.36±1.17

3 討論

本試驗(yàn)探討了石榴皮中安石榴苷大孔吸附樹脂純化工藝，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，用6 BV 8%乙醇進(jìn)行除雜后，再用含0.01% NaOH 的純化水在室溫條件下洗脫，接收3 BV 黃色條帶流分，安石榴苷總收率可達(dá)到（69.66±0.87）%，純度由（44.77±1.77）% 提高至（84.56±0.13）%。本課題組將進(jìn)一步研究鑒定安石榴苷精制物中其他的組分，為安石榴苷精制物作為原料藥的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。安石榴苷精制物具有很強(qiáng)的吸濕性，其對溫度最為敏感，在光照條件下不穩(wěn)定。鞣花酸及安石榴林為安石榴苷主要的降解產(chǎn)物，對于安石榴苷的其他降解產(chǎn)物還需要進(jìn)行深入研究，為了保證安石榴苷精制物的穩(wěn)定性，應(yīng)將其放置于低溫、干燥密閉的容器中避光存儲。

3.1 純化工藝的優(yōu)點(diǎn)

本文根據(jù)安石榴苷的特性對其純化工藝中的解吸附條件進(jìn)行了優(yōu)化，首次采用含堿的水作為洗脫劑，大大節(jié)省了有機(jī)溶劑的使用量。本文首次將大孔吸附樹脂聯(lián)合膜分離技術(shù)應(yīng)用于安石榴苷的純化工藝中，大孔吸附樹脂技術(shù)具有選擇性強(qiáng)、機(jī)械強(qiáng)度大、吸附容量大、吸附速度快、易再生、可循環(huán)使用、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物分離純化、中藥制劑的純化，有害雜質(zhì)的去除等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。納濾膜耗能低、成本低且可在室溫條件下進(jìn)行，特別適用于對熱敏感的物質(zhì)的分離。還可去除洗脫液中部分小分子量的物質(zhì)如有機(jī)物、無機(jī)鹽，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步純化。因此既可以得到高純度的安石榴苷又能有較高的收率。在試驗(yàn)過程中從樣品溶液的吸附到解吸附及濃縮，整個(gè)工藝過程可在24 h 內(nèi)完成，工藝簡單、效率較高且易于控制。并將該工藝進(jìn)行了中試放大試驗(yàn)，工藝可行，可以用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 純化工藝中的注意事項(xiàng)

在大孔吸附樹脂純化工藝中，洗脫劑的pH對安石榴苷的影響較大，安石榴苷為弱酸性，安石榴苷在堿性較強(qiáng)的條件下不穩(wěn)定，應(yīng)將收集的洗脫液pH 調(diào)至弱酸性，再進(jìn)行濃縮。由于該工藝中所用的洗脫溶劑為水且安石榴苷對熱敏感，使用傳統(tǒng)的減壓濃縮不僅效率低，而且在加熱過程中容易導(dǎo)致安石榴苷受熱降解。因此濃縮工藝在室溫條件下進(jìn)行較好。

綜上，本試驗(yàn)建立的安石榴苷的純化方法有效可行，適用于安石榴苷的工業(yè)化生產(chǎn)，并為安石榴苷精制物的存儲提供了理論依據(jù)。