林志軍，楊順良

作者單位：1聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院、廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院門(mén)診部，福建 漳州363000；

2漳州市中醫(yī)院心血管科，福建 漳州363000

心肌缺血再灌注損傷是心血管疾病中常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，也是引起心血管疾病的重要原因之一，因此，尋找防治心肌缺血再灌注損傷的藥物是研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有效果明顯，毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，其具有抑制氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞自噬、降低細(xì)胞凋亡率等作用，對(duì)防治缺血再灌注損傷具有較好應(yīng)用前景［2］。金雀異黃酮（GEN）又稱染料木黃酮，是一種大豆異黃酮的主要活性成分，研究表明，GEN 可顯著提高細(xì)胞存活率，降低乳酸脫氫酶（LDH）漏出率，減少細(xì)胞凋亡，對(duì)成骨細(xì)胞缺氧損傷具有明顯保護(hù)作用［3］。GEN 對(duì)脂多糖（LPS）處理的軟骨細(xì)胞增殖抑制有拮抗作用，且具有抗炎作用［4］。GEN 還能減輕睪丸缺血和再灌注損傷引起的生精損傷和氧化應(yīng)激［5］。GEN 對(duì)糖尿病大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕心肌炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)［6］。以上表明GEN具有較好的抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡的作用。轉(zhuǎn)膠蛋白-2（TAGLN2）是鈣蛋白家族的細(xì)胞骨架蛋白，研究表明TAGLN2 在心肌梗死大鼠心肌組織中上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-133a通過(guò)抑制TAGLN2 表達(dá)減少心肌梗死后的心肌凋亡［7］。抑制TAGLN2 表達(dá)可降低LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷［8］。因此，本研究于2018年10月至2019 年11 月采用缺氧復(fù)氧（H/R）建立心肌細(xì)胞損傷模型，研究GEN 對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響，探討GEN 對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用，且研究其作用機(jī)制是否與TAGLN2有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料心肌細(xì)胞H9c2（美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（北京天恩澤生物技術(shù)有限公司）；GEN（湖北鴻鑫瑞宇精細(xì)化工有限公司）；BCA 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液（廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白V（Annerxin V）/異硫氰酸熒光素（FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京博邁斯科技發(fā)展有限公司）；丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司）；熒光定量PCR 試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型建立心肌細(xì)胞H9c2復(fù)蘇后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞先在無(wú)血清低糖培養(yǎng)基中95%氮?dú)狻?%二氧化碳的培養(yǎng)箱缺氧3 h，然后換成含血清的高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱復(fù)氧4 h，建立H/R 模型（H/R 組），常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3 細(xì)胞處理與分組用濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的GEN處理H9c2細(xì)胞后再進(jìn)行H/R處理，記為GEN低、中、高濃度組；將小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）、TAGLN2 小干擾RNA（si-TAGLN2）轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中再進(jìn)行H/R處理，記為H/R+si-NC組、H/R+si-TAGLN2組；將空載體質(zhì)粒（pcDNA）、TAGLN2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-TAGLN2）轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中用20 mg/L GEN處理再進(jìn)行H/R處理，記為H/R+GEN+pcDNA組、H/R+GEN+pcDNA-TAGLN2組。

1.4 試劑盒檢測(cè)丙二醛含量及SOD、GSH-Px 活性細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后收集各組細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液漂洗2 次，與500 μL 的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μL 的Annexin VFITC，再加入5μL 的碘化丙啶，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X（Bax）、TAGLN2 蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白并用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，用5%的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗4 ℃過(guò)夜，加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達(dá)水平=目的條帶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）條帶的比值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)TAGLN2 mRNA 表達(dá)水平各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），TAGLN2以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，TAGLN2 正向引物序列：5′-GCATGTTTCT?GCCTTCCTGAC-3′，反向引物序列：5′-TCTCCTC?CACTCCACCCCTTA-3′；GAPDH 正向引物序列：5′-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，反向引物序列：5′-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3′。循環(huán)條件為95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2?ΔΔCt法計(jì)算。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組比較行成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEN 對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響與對(duì)照組相比，H/R 組心肌細(xì)胞中丙二醛含量升高，SOD、GSH-Px 活性降低（P<0.05）；與H/R 組相比，GEN 低、中高濃度組丙二醛含量降低，SOD、GSH-Px 活性升高，且呈濃度依賴性（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激的影響/± s

表1 金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激的影響/± s

注：SOD為超氧化物歧化酶，GSH-Px為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與H/R 組比較，P<0.05。③與H/R+GEN-L組比較，P<0.05。④與H/R+GEN-M組比較，P<0.05。

99999重復(fù)次數(shù)GSH-Px/（U/mL）69.32±6.11 12.41±1.23①24.11±2.41②36.98±3.57②③57.36±5.74②③④271.94<0.001組別對(duì)照H/R H/R+GEN-L H/R+GEN-M H/R+GEN-H F值P值丙二醛/（nmol/L）3.54±0.34 11.02±1.17①8.82±0.79②6.33±0.61②③4.87±0.46②③④152.08<0.001 SOD/（U/mL）46.36±4.17 9.56±0.98①17.37±1.65②28.06±2.78②③38.65±3.44②③④250.16<0.001

2.2 GEN 對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比，H/R 組心肌細(xì)胞中Bax 表達(dá)水平升高，Bcl-2 表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與H/R 組相比，GEN 低、中高濃度組Bax 表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率降低，且呈濃度依賴性（P<0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響/± s

表2 金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響/± s

注：Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與H/R 組比較，P<0.05。③與H/R+GEN-L組比較，P<0.05。④與H/R+GEN-M組比較，P<0.05。

重復(fù)次數(shù)99999 Bax蛋白0.22±0.02 0.63±0.05①0.51±0.04②0.39±0.04②③0.28±0.03②③④175.63<0.001組別對(duì)照H/R H/R+GEN-L H/R+GEN-M H/R+GEN-H F值P值凋亡率/%7.25±0.71 25.36±2.14①19.68±1.87②14.02±1.58②③10.22±1.03②③④197.08<0.001 Bcl-2蛋白0.74±0.06 0.31±0.03①0.43±0.04②0.55±0.05②③0.68±0.06②③④114.97<0.001

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 GEN 對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TAGLN2 表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，H/R 組心肌細(xì)胞中TAGLN2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與H/R 組相比，GEN 低、中高濃度組TAGLN2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低，且呈濃度依賴性（P<0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中TAGLN2蛋白的影響

表3 金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中轉(zhuǎn)膠蛋白-2（TAGLN2）表達(dá)的影響/± s

表3 金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中轉(zhuǎn)膠蛋白-2（TAGLN2）表達(dá)的影響/± s

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與H/R 組比較，P<0.05。③與H/R+GEN-L組比較，P<0.05。④與H/R+GEN-M組比較，P<0.05。

TAGLN2蛋白0.39±0.03 0.83±0.07①0.71±0.06②0.59±0.05②③0.47±0.04②③④105.07<0.001組別對(duì)照H/R H/R+GEN-L H/R+GEN-M H/R+GEN-H F值P值重復(fù)次數(shù)99999 TAGLN2 mRNA 1.00±0.05 3.11±0.31①2.55±0.27②2.06±0.21②③1.42±0.14②③④137.31<0.001

2.4 抑制TAGLN2表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響與H/R+si-NC 組相比，H/R+si-TAGLN2 組TAGLN2 表達(dá)水平降低，丙二醛含量降低，SOD、GSH-Px 活性升高，Bax 表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 抑制TAGLN2表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷的影響/± s

表4 抑制TAGLN2表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷的影響/± s

注：TAGLN2為轉(zhuǎn)膠蛋白-2，SOD為超氧化物歧化酶，GSH-Px為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X。

組別H/R+si-NC H/R+si-TAGLN2 t值P值Bax蛋白0.64±0.06 0.31±0.03 14.76<0.001重復(fù)次數(shù)99 TAGLN2蛋白0.85±0.07 0.41±0.04 16.37<0.001丙二醛/（nmol/L）11.46±1.13 5.26±0.51 15.00<0.001 SOD/（U/mL）9.42±0.94 31.25±3.12 20.10<0.001 GSH-Px/（U/mL）13.65±1.34 49.87±5.41 19.50<0.001凋亡率/%26.14±2.33 12.48±1.24 15.53<0.001 Bcl-2蛋白0.33±0.03 0.65±0.06 14.31<0.001

2.5 TAGLN2 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了GEN（20 mg/L）對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用與H/R+GEN+pcDNA 組相比，H/R+GEN+pcDNA-TAGLN2 組TAGLN2 表達(dá)水平升高，丙二醛含量升高，SOD、GSH-Px 活性降低，Bax 表達(dá)水平升高，Bcl-2 表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。見(jiàn)圖3、表5。

表5 TAGLN2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷的作用/± s

表5 TAGLN2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷的作用/± s

注：TAGLN2為轉(zhuǎn)膠蛋白-2，SOD為超氧化物歧化酶，GSH-Px為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X。①與H/R組比較，P<0.05。②與H/R+GEN+pcDNA 組比較，P<0.05。

組別H/R H/R+GEN H/R+GEN+pcDNA H/R+GEN+pcDNA-TAGLN2 F值P值重復(fù)次數(shù)9999 TAGLN2蛋白0.86±0.07 0.44±0.04①0.43±0.03 0.74±0.06②153.25<0.001丙二醛/（nmol/L）12.14±1.15 4.95±0.48①4.88±0.48 9.36±0.94②170.60<0.001 SOD/（U/mL）9.32±0.93 39.14±3.84①39.66±3.91 15.58±1.45②271.28<0.001 GSH-Px/（U/mL）12.39±1.27 56.39±5.32①46.87±5.61 19.36±1.82②250.02<0.001 Bax蛋白0.65±0.06 0.29±0.03①0.27±0.03 0.56±0.05②166.90<0.001凋亡率/%27.11±2.71 11.26±1.13①10.98±1.07 22.65±2.41②153.58<0.001 Bcl-2蛋白0.30±0.03 0.67±0.06①0.69±0.05 0.39±0.04②162.52<0.001

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TAGLN2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了金雀異黃酮（GEN）對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

3 討論

心血管疾病的發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類身體健康，而在心血管疾病的治療過(guò)程中，心肌缺血再灌注損傷可進(jìn)而加重原有的心血管疾病，進(jìn)而導(dǎo)致病人病情惡化，缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制與氧自由基、能量代謝障礙、炎癥、細(xì)胞凋亡等均相關(guān)［9］。心肌缺血再灌注過(guò)程中心肌組織可產(chǎn)生大量活性氧，而活性氧的堆積會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，從而引起心肌細(xì)胞損傷［10-11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)缺氧復(fù)氧建立心肌細(xì)胞損傷模型，對(duì)心肌細(xì)胞H9c2 進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理后心肌細(xì)胞中丙二醛含量升高，SOD、GSH-Px 活性降低，Bax 表達(dá)水平升高，Bcl-2 表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率升高。SOD、GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)抗氧化酶，可以清除自由基；丙二醛是一種過(guò)氧化產(chǎn)物，其水平可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度［12-14］。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺氧復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，心肌細(xì)胞損傷模型建立成功。

研究表明中藥在治療心肌缺血再灌注損傷中有一定優(yōu)勢(shì)，其可為臨床上減輕缺血再灌注損傷提供新途徑［15］。有報(bào)道GEN 預(yù)處理可抑制缺血誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，并降低中風(fēng)小鼠的丙二醛水平；改善神經(jīng)功能缺損并防止缺血后細(xì)胞凋亡［16］。且有研究表明GEN 預(yù)處理可通過(guò)清除氧自由基，抑制細(xì)胞凋亡對(duì)大鼠肝臟熱缺血再灌注起保護(hù)作用［17］。金雀異黃素還能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎性遞質(zhì)改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)肝損傷［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GEN 預(yù)處理后，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中丙二醛含量降低，SOD、GSH-Px 活性升高，Bax 表達(dá)水平降低，Bcl-2 表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率降低。表明GEN 可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

有研究報(bào)道抑制TAGLN2 表達(dá)可降低LPS 誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞凋亡和活性氧水平［8］。miR-133a通過(guò)抑制心肌細(xì)胞中TAGLN2的表達(dá)減弱缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TAGLN2 表達(dá)水平升高，抑制TAGLN2表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，即可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，GEN 處理后TAGLN2 表達(dá)水平降低。過(guò)表達(dá)TAGLN2 逆轉(zhuǎn)了GEN 對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。提示，GEN 可能通過(guò)調(diào)控TAGLN2的表達(dá)影響心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，GEN 通過(guò)下調(diào)TAGLN2 表達(dá)可保護(hù)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。