萬 敏，譚晶晶，周 林

（湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430014）

免疫性血小板減少性紫癜（ITP）是以外周血血小板破壞過多、血小板數(shù)量顯著減少、皮膚黏膜出血或伴有內(nèi)臟出血傾向為主要特征的出血性疾?。?-2］。臨床多以糖皮質(zhì)激素及脾切除術(shù)治療該病，但激素類藥品不良反應(yīng)較多，不適合長期應(yīng)用，脾切除術(shù)造成的繼發(fā)感染、敗血癥等術(shù)后并發(fā)癥亦不可忽視［3］。中醫(yī)辨證施治可有效緩解ITP患者的臨床癥狀，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能［4-5］。健脾益氣攝血方以四君子湯為基礎(chǔ)，增加黃芪、阿膠、茜草以固氣止血，有健脾益氣、養(yǎng)血止血功效，能提升血小板數(shù)量、改善出血，但具體作用機(jī)制尚不明晰［6-7］。輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的平衡狀態(tài)對于維持機(jī)體正常免疫功能及防止炎性反應(yīng)具有重要意義，Th17/Treg細(xì)胞的免疫功能失衡是目前ITP機(jī)制研究的熱點(diǎn)［8］。本研究中探討了健脾益氣攝血方對模型小鼠ITP的改善作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Fresco17型低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；7180型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；CX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Cyto-FLEX型流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）；Infinite F50型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；EC3型凝膠電泳裝置（美國Bio-Rad公司）；HH-501型恒溫水浴箱（浙江賽德儀器設(shè)備有限公司）。

試藥：由健脾益氣攝血方（本課題組從我院藥房取各組方藥材制備）；醋酸潑尼松片（國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號為200220）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（生工生物工程＜上海＞有限公司，批號為0316S08）；CD4-PE，CD25-PE，白細(xì)胞介素（IL）-17-FITC，F(xiàn)oxp3-FITC流式抗體（美國BD公司，批號分別為362041，362033，362045，362037）；小鼠IL-17、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、IL-10酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為20200521，20200510，20200528，20200604）；孤獨(dú)核受體（RORγt）、叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、β-actin一抗（美國RD公司，批號分別為223511，223413，223517）。

動物：SPF級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g；SPF級豚鼠，雌性，6周齡，體質(zhì)量300～400 g，均由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2015-0018。自由飲食飲水，飼養(yǎng)于溫度為22～25℃、相對濕度為52%～55%的SPF級實驗動物房中。本研究經(jīng)醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）制備

抗原制備：小鼠摘眼球取血，使用乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝，離心，分離血小板并洗滌，用生理鹽水稀釋血小板密度至109L-1，隨后與等量完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑充分混合，即得抗原。

免疫：將含完全福氏佐劑的抗原于豚鼠足掌、背部及皮下6點(diǎn)注射，分別于注射后第1，2，4周取含不完全福氏佐劑的抗原，注射于豚鼠足掌、背部及皮下6點(diǎn)，豚鼠于末次注射后第6天取心臟不抗凝血，分離，即得GP-APS，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

GP-APS稀釋液制備：取GP-APS適量，置56℃水浴30 min滅活，以等量小鼠紅細(xì)胞至少吸附2次，用生理鹽水稀釋至1∶4（V/V），備用。

1.2.2 建模、分組與給藥

將60只小鼠隨機(jī)分為空白對照組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水）、醋酸潑尼松組（5 mg/kg）及健脾益氣攝血方低、中、高劑量組（6.96，13.91，27.82 g/kg），各10只。除空白對照組外，其余各組小鼠分別于第1，3，5，7，9，11，13天腹腔注射GP-APS稀釋液（每10 g體質(zhì)量100μL）以復(fù)制TIP模式，注射第6小時，血小板開始減少，第8小時降至最少，為建模成功。各組小鼠均從首次注射GP-APS后24 h時開始灌胃相應(yīng)藥物或生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。

1.3 觀察指標(biāo)

外周血血小板計數(shù)：分別于給藥后7，14 d取眼眶靜脈血10μL，采用全自動血細(xì)胞分析儀測定小鼠外周血血小板并計數(shù)。

腎臟、脾臟組織病理形態(tài)學(xué)：末次給藥后，小鼠眼球取血，處死，解剖后取部分腎臟、脾臟組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切5μm厚片，HE染色，中性樹膠封片，200倍光鏡下觀察。

脾臟組織中Th17和Treg細(xì)胞比例：處死小鼠，取部分脾組織，剪碎，研磨，加入RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中，過200目尼龍網(wǎng)，收集于無菌離心管，3 000 r/min離心5 min，取上清液，加入紅細(xì)胞裂解液，3 000 r/min離心5 min，取上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，加入RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，3 000 r/min離心5 min，取上清液，重懸細(xì)胞，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為1×107mL-1，取100μL細(xì)胞懸液，分別加入FITC-CD4與APCCD25單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，固定液避光室溫20 min，去上清，PBS洗滌2次，加入PE-IL-17及PE-Foxp3進(jìn)行染色，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，采用流式細(xì)胞儀檢測。

血清IL-17，IL-6，TGF-β1，IL-10水平：于小鼠眼球取血，常溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離，得血清，-20℃貯存。采用ELISA法檢測，標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入血清樣品10μL，加入樣品稀釋液40μL，抗體100μL，同時設(shè)置空白孔，37℃孵育1 h，洗滌6次，依次加入顯色液A和B各50μL，37℃避光顯色15 min，加入終止液50μL，15 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各反應(yīng)孔的吸光度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

脾臟組織RORγt和Foxp3的mRNA表達(dá)水平：取小鼠部分脾臟組織，以Trizol提取組織總RNA，測定總RNA濃度，取2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行RTPCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 s，退火溫度70℃20 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸1 min，結(jié)果以2-ΔΔCt法分析mRNA相對表達(dá)量。RORγt，正向，GCCGCGGAGCAGACACACTT，反向，GGAGGCCCCCTGGACCTCTG；Foxp3，正 向，CAGGAGAAAGCGGATACCAAATG，反 向，ATCTGTGAGGACTACCGAGCC；β-actin，正向，GCAGAAGGAGATTACTGCTCT，反向，GCTGATCCACATCTGCTGGAA。

脾臟組織RORγt和Foxp3的蛋白表達(dá)：取小鼠部分脾臟組織，勻漿后加入RIPA裂解液，提取組織總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。取10μL蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，冰上轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，二抗室溫結(jié)合2 h，ECL顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 外周血血小板計數(shù)

與空白對照組比較，模型組小鼠給藥前及給藥7 d和14 d時的血小板計數(shù)顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，健脾益氣攝血方低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組治療7 d和14 d時的血小板計數(shù)顯著增多（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組小鼠外周血血小板計數(shù)比較（±s，×109 L-1，n=10）Tab.1 Comparison of platelet count in peripheral blood of mice in each group（±s，×109 L-1，n=10）

表1 各組小鼠外周血血小板計數(shù)比較（±s，×109 L-1，n=10）Tab.1 Comparison of platelet count in peripheral blood of mice in each group（±s，×109 L-1，n=10）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。表2至表3，圖3至圖4同。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.01（for Tab.1-3 and Fig.3-4）；Compared with those in the model group，#P＜0 05，##P＜0.01（for Tab.1-3 and Fig.3-4）.

給藥14 d 421.72±67.15 79.64±33.27*309.80±83.54##168.95±57.36##240.43±48.09##278.97±54.32##組別空白對照組模型組醋酸潑尼松組健脾益氣攝血方低劑量組健脾益氣攝血方中劑量組健脾益氣攝血方高劑量組劑量（mg/kg）5 6 960 13 910 27 820給藥前413.26±72.13 77.29±22.45*71.08±26.71 75.74±18.36 76.90±25.07 73.42±19.05給藥7 d 405.28±84.02 74.52±29.10*240.54±43.24##121.65±49.15#197.89±30.59##216.37±35.02##

2.2 腎臟、脾臟組織病理形態(tài)學(xué)

空白對照組小鼠腎臟及脾臟組織形態(tài)規(guī)則，胞漿豐富，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞索排列整齊；模型組小鼠可見炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小球擴(kuò)張；脾臟內(nèi)可見發(fā)育異常的骨髓巨核細(xì)胞大量增多，各用藥組小鼠腎小球損傷、炎性浸潤及腎小管上皮水腫情況減輕，腎組織損傷均不同程度改善，脾臟內(nèi)的異常骨髓巨核細(xì)胞數(shù)量均不同程度減少。詳見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟脾臟組織病理形態(tài)學(xué)（HE，×200）a.Blank control group b.Model group c.Prednisone acetate group d-f.Jianpi Yiqi Shexue Formula low-，medium-and high-dose groups A.Kidney tissue B.Spleen tissueFig.1 Histopathophology of kidney and spleen tissue of mice in each group（HE staining，×200）

2.3 脾臟組織中Th17及Treg細(xì)胞比例

與空白對照組比較，模型組小鼠脾臟中Th17（CD4+IL-17+）細(xì)胞顯著增多，Treg（CD4+CD25+Foxp3+）細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組小鼠脾臟中Th17細(xì)胞顯著減少，Treg細(xì)胞顯著增多（P＜0.05或P＜0.01），Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡現(xiàn)象明顯改善。詳見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠流式細(xì)胞圖a.Blank control group b.Model group c.Prednisone acetate group d-f.Jianpi Yiqi Shexue Formula low-，medium- and high-dose groups A.Th17 B.TregFig.2 Flow cytometry of mice in each group

圖3 各組小鼠外周血中Th17及Treg細(xì)胞比例a.Blank control group b.Model group c.Prednisone acetate group d-f.Jianpi Yiqi Shexue Formula low-，medium- and high-dose groups A.Th17 B.TregFig.3 Proportion of Th17 and Treg cells in peripheral blood of mice in each group

2.4 血清IL-17，IL-6，TGF-β1，IL-10水平

與空白對照組比較，模型組小鼠血清中IL-17，IL-6，TGF-β1水平顯著升高，IL-10含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組小鼠血清IL-17，IL-6，TGF-β1水平顯著降低，IL-10水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-17，IL-6，IL-10，TGF-β1水平比較（±s，pg/mL，n=10）Tab.2 Comparison of IL-17，IL-6，IL-10 and TGF-β1 levels in serum of mice in each group（±s，pg/mL，n=10）

表2 各組小鼠血清中IL-17，IL-6，IL-10，TGF-β1水平比較（±s，pg/mL，n=10）Tab.2 Comparison of IL-17，IL-6，IL-10 and TGF-β1 levels in serum of mice in each group（±s，pg/mL，n=10）

IL-10 59.06±6.25 30.54±7.82*50.70±9.43##37.59±6.12#41.62±9.53#45.31±6.07##組別空白對照組模型組醋酸潑尼松組健脾益氣攝血方低劑量組健脾益氣攝血方中劑量組健脾益氣攝血方高劑量組IL-17 37.51±7.38 69.34±10.41*44.56±7.29##56.56±9.75#52.17±8.62##48.35±9.30##IL-6 57.90±11.17 96.59±13.02*70.22±10.54##83.61±9.05#76.52±10.27##72.34±8.64##TGF-β1 63.78±8.66 131.50±17.83*79.52±10.54##98.38±19.52##90.40±17.95##84.76±18.50##

2.5 脾臟組織中RORγt和Foxp3的mRNA表達(dá)水平

與空白對照組比較，模型組小鼠脾臟組織RORγt mRNA表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組小鼠脾臟組織RORγt mRNA表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。詳見表3。

表3 各組小鼠脾臟組織RORγt和Foxp3的mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of RORγt and Foxp3 mRNA expression levels in spleen tissue of mice in each group（±s，n=10）

表3 各組小鼠脾臟組織RORγt和Foxp3的mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of RORγt and Foxp3 mRNA expression levels in spleen tissue of mice in each group（±s，n=10）

組別空白對照組模型組醋酸潑尼松組健脾益氣攝血方低劑量組健脾益氣攝血方中劑量組健脾益氣攝血方高劑量組RORγt mRNA 0.24±0.05 0.72±0.06*0.45±0.04##0.64±0.07##0.56±0.06##0.49±0.03##Foxp3 mRNA 0.93±0.10 0.44±0.06*0.76±0.07##0.58±0.04##0.62±0.06##0.70±0.05##

2.6 脾臟組織中RORγt和Foxp3的蛋白表達(dá)水平

與空白對照組比較，模型組小鼠脾臟組織中RORγt的蛋白表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)oxp3的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組小鼠脾臟組織RORγt蛋白表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 各組小鼠脾臟組織中RORγt和Foxp3的蛋白表達(dá)水平a.Blank control group b.Model group c.Prednisone acetate group d-f.Jianpi Yiqi Shexue Formula low-，medium- and high-dose groups A.Electrophoretogram B.Statistical data（B1.RORγt；B2.Foxp3）Fig.4 Expression of RORγt and Foxp3 protein in spleen tissue of mice in each group

3 討論

ITP是由于機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫失衡導(dǎo)致外周血中血小板減少，約占出血性疾病總數(shù)的30%，以血小板計數(shù)偏低、皮膚黏膜及內(nèi)臟出血傾向、骨髓巨核細(xì)胞成熟障礙等為主要特征［1-2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對該病仍缺乏有效的治療方法，糖皮質(zhì)激素為首選治療藥物，但長期大量應(yīng)用藥品不良反應(yīng)較大，部分患者可產(chǎn)生藥物依賴或抗藥性；采用脾切除術(shù)亦有繼發(fā)感染、敗血癥等并發(fā)癥風(fēng)險［3］。中醫(yī)臨床針對本病本虛標(biāo)實的主要病機(jī)，根據(jù)“急則治其標(biāo)，緩則治其本”的原則辨證施治，不僅能有效改善出血癥狀，還可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，減輕血小板的破壞程度，恢復(fù)血小板計數(shù)的正常水平［4-5］。

根據(jù)ITP的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸入“血證”“發(fā)斑”“葡萄疫”等范疇，認(rèn)為病機(jī)總屬本虛標(biāo)實，虛多實少，實證常見熱毒、瘀血，虛證多為脾氣虧虛、氣不攝血［9］。脾為后天之本，氣血生化之源，《血證論》云：“治血者，必以脾為主，乃為有要。至于治氣，亦宜以脾為主。”［10］脾氣健旺則氣血充足，脾主統(tǒng)血功能正常則血液能正常循行脈中而不致溢于脈外；脾氣虧虛，不能固攝血液則血不循經(jīng)，導(dǎo)致出血傾向［11］，可見ITP的治療應(yīng)以健脾益氣為主要原則。

健脾益氣攝血方在補(bǔ)氣基礎(chǔ)方四君子湯基礎(chǔ)上增加止血藥物，方中黃芪性溫味甘，有益氣健脾、升舉下陷、固氣攝脫功效，常用治氣不攝血、氣血兩虛證，為君藥；黨參性平味甘，有補(bǔ)中益氣、健脾益肺功效，茯苓性平味甘淡，有健脾和胃、利水滲濕、寧心安神功效，白術(shù)性溫味苦，有健脾益氣、燥濕利水功效，三藥共為臣藥；阿膠補(bǔ)血攝血、滋陰潤燥，茜草逐瘀通經(jīng)、涼血止血，二藥一清一補(bǔ)，配伍使用可使止血療效大增，共為佐藥；炙甘草益氣和中，緩和藥性，為使藥。諸藥合用，共奏健脾益氣、養(yǎng)血止血功效。臨床實踐證明，健脾益氣攝血方能有效提升ITP患者的血小板計數(shù)，改善臨床癥狀，且藥品不良反應(yīng)少，具有較高的應(yīng)用價值［6-7］。

細(xì)胞免疫及體液免疫紊亂是ITP的主要發(fā)病機(jī)制，其中Th17及Treg免疫功能失衡是目前ITP機(jī)制研究的熱點(diǎn)［8］。Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，能特異性地分泌IL-17，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)及造成免疫紊亂，其介導(dǎo)的自身免疫性損傷可能是ITP發(fā)生的重要機(jī)制。Treg屬具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，其特異性胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的上調(diào)可促進(jìn)IL-10等抑炎細(xì)胞因子表達(dá)，減輕機(jī)體過度免疫和炎性反應(yīng)［12-14］。Th17與Treg在功能上相互制約，其平衡狀態(tài)對于維持機(jī)體正常免疫功能、防止炎性及自身免疫性疾病至關(guān)重要［15-16］。

本研究結(jié)果表明，健脾益氣攝血方能明顯升高ITP模型小鼠外周血血小板計數(shù)，減輕腎臟及脾臟組織損傷，改善骨髓巨核細(xì)胞成熟障礙，且具有劑量依賴性，以高劑量改善更明顯。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，經(jīng)健脾益氣攝血方處理后，脾臟中Th17（CD4+IL-17+）細(xì)胞比例較模型組顯著減少，Treg（CD4+CD25+Foxp3+）細(xì)胞比例明顯增加，提示該方明顯改善了ITP模型小鼠Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡現(xiàn)象。TGF-β1和IL-6是誘導(dǎo)Th17分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能通過刺激初始T細(xì)胞、激活Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt來誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化［17-18］。與空白對照組比較，模型組小鼠血清中IL-17，IL-6，TGF-β1水平均明顯升高，IL-10水平明顯降低，脾臟組織RORγt蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯升高，F(xiàn)oxp3則明顯降低。提示IL-6和TGF-β1水平均升高，激活RORγt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化及IL-17過表達(dá)，同時抑制Treg細(xì)胞功能，導(dǎo)致Treg/Th7細(xì)胞免疫失衡，可能是ITP的重要發(fā)病機(jī)制。與模型組比較，各用藥組小鼠血清中IL-17，IL-6，TGF-β1水平均明顯降低，IL-10水平明顯升高，脾臟組織中RORγt的蛋白及mRNA的表達(dá)水平均明顯降低，F(xiàn)oxp3則明顯升高，表明該方可能通過降低RORγt及Th17細(xì)胞因子的表達(dá)抑制Th17細(xì)胞增殖，同時通過上調(diào)Foxp3表達(dá)，恢復(fù)Treg細(xì)胞功能，從而改善Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡，減輕模型小鼠血小板的持續(xù)降低及脾腎組織的損傷，發(fā)揮對ITP的改善作用。

綜上所述，健脾益氣攝血方對模型小鼠的ITP有明顯改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡有關(guān)。