尹德晶，吳 燕，岳 筠，楊 鵬，陳 靜，王 慧，張雙翔，王開(kāi)功,2*，程振濤,2*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550008)

絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc)會(huì)引起山羊肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜炎和敗血癥等，主要引起山羊發(fā)生肺炎，感染羊表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸窘迫、發(fā)熱、黏液性鼻液和死亡，可侵害不同年齡、性別的山羊，發(fā)病率為45%～90%，死亡率為14%～50%[1-2]。Mmc和綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)均可引起羊支原體肺炎(mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG)，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，Mmc是引起山羊支原體肺炎的病原之一[3]，Mmc具有廣泛的地理分布性，只感染山羊且致病性強(qiáng)于Mo，由于貴州省當(dāng)前大力發(fā)展養(yǎng)羊業(yè)，育有貴州黑山羊、貴州白山羊、黔北麻羊等優(yōu)秀地方品種，必須重視Mmc的危害[4-5]。

當(dāng)前對(duì)Mmc的研究主要集中于菌株的分離鑒定[6]、基因序列分析[7]及檢測(cè)方法的建立[8]，對(duì)如何阻斷Mmc傳播的研究仍然是空白，Mmc雖然致死率不高，但感染羊的精液或者乳制品質(zhì)量下降，并且通過(guò)精液和乳汁傳播該病，感染嚴(yán)重的羊甚至發(fā)生流產(chǎn)[9]。因此，急需找到防控Mmc傳播的手段，本研究基于Mmc貴州株的LppA蛋白N末端基因通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-LppA，以期作為DNA疫苗有效防控羊支原體肺炎。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞及動(dòng)物

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pMD19-T-LppA克隆質(zhì)粒、真核表達(dá)載體pVAX1、MDBK細(xì)胞、羊源LppA蛋白、Mmc貴州株均由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；Mmc羊源陽(yáng)性/陰性血清來(lái)源為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)間接血凝試驗(yàn)(IHA)陽(yáng)性血清/陰性血清，4～5周齡BALB/c小鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、LipofecttamineTM3000、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大、小量提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-4、干擾素-γ(IFN-γ)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗羊IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、兔抗羊IgG-FITC均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PE標(biāo)記CD4+抗體、CY5標(biāo)記的CD8+抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 重組質(zhì)粒pVAX1-LppA構(gòu)建

結(jié)合Mmc標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G3(登錄號(hào)：NZ_JFAE01000018.1)LppA基因序列和pVAX1載體酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(F:5′-AAGCTTACCACCATGAGTTTGCAAGAAACAGACAAAGATG-3′,R:5′-CTCGAGCTATCCCCTAGAATCAATACCAAAATC-3′，下劃線(xiàn)示酶切位點(diǎn))，預(yù)擴(kuò)期增片段為450 bp，PCR擴(kuò)增LppA基因片段，膠回收目的基因并純化，用限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ分別對(duì)pVAX1載體和純化產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，T4連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，通過(guò)重組質(zhì)粒PCR、雙酶切及測(cè)序進(jìn)行鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒pVAX1-LppA體外表達(dá)鑒定

經(jīng)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA并測(cè)定濃度，將轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒按照比例混合制備脂質(zhì)體，室溫穩(wěn)定15 min，轉(zhuǎn)染至長(zhǎng)至80% MDBK細(xì)胞的6孔板中，同時(shí)設(shè)置空載體pVAX1轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48 h后，提取重組質(zhì)粒pVAX1-LppA組和空載體pVAX1組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR方法擴(kuò)增LppA基因，檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平。以Mmc陽(yáng)性血清為一抗，F(xiàn)ITC-兔抗羊IgG為二抗，對(duì)pVAX1-LppA組、空載體pVAX1對(duì)照組以及空白對(duì)照組MDBK細(xì)胞分別進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)(IFA)。

1.5 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

1.5.1 小鼠分組與免疫 為評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒pVAX1-LppA的免疫效果及最佳接種劑量，試驗(yàn)選用100只6周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分為5組，每組20只，分別于肌肉接種無(wú)菌PBS 100 μL、空載體pVAX1 100 μg、重組質(zhì)粒pVAX1-LppA50 μg、重組質(zhì)粒pVAX1-LppA100 μg、重組質(zhì)粒pVAX1-LppA150 μg，首次免疫后每間隔1周以相同途徑、劑量加強(qiáng)免疫，共免疫3次。

1.5.2 血清抗體水平檢測(cè) 免疫后連續(xù)8周采集小鼠血清樣本，用LppA蛋白(0.2 μg·mL-1)包被酶標(biāo)板、3%BSA封閉、加入待檢樣本(1∶50稀釋)、HRP-羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)作為二抗標(biāo)記、顯色后用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣本OD630 nm值以檢測(cè)特異性抗體水平。

1.5.3 細(xì)胞因子分泌水平測(cè)定 為了評(píng)價(jià)血清中細(xì)胞因子的水平，免疫后連續(xù)8周采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清中IL-2、IL-4和IFN-γ 3種細(xì)胞因子水平，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各細(xì)胞因子含量。

1.5.4 脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè) 免疫后連續(xù)8周每組隨機(jī)取2只小鼠，無(wú)菌分離脾淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為104cell·mL-1，取96孔板每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，試驗(yàn)組每孔再加入50 μL刀豆素(ConA 25 μg·mL-1)、空白組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL噻唑藍(lán)溶液(MTT 5 mg·mL-1)，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)1 h后測(cè)OD490 nm值。

1.5.5 脾T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 流式染色緩沖液調(diào)整脾淋巴細(xì)胞為107cell·mL-1，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞和CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞，并以PE-CD4+和CY5-CD8+細(xì)胞抗體檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的比例。

1.6 攻毒保護(hù)性試驗(yàn)

末次免疫后第14天，每組隨機(jī)取5只小鼠分別接種Mmc菌液(1×108CCU·mL-1)，攻毒后進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，每日觀察并記錄攻毒后小鼠的臨床癥狀，攻毒后第14天處死所有小鼠并解剖，通過(guò)眼觀和病理切片觀察肺病理變化，并以采食下降、精神沉郁等臨床癥狀為感染標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)分析重組質(zhì)粒pVAX1-LppA的攻毒保護(hù)效果。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-LppA構(gòu)建

將LppA基因片段連至真核載體pVAX1，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增出現(xiàn)450 bp大小目的條帶，空白對(duì)照無(wú)條帶(圖1)；雙酶切呈現(xiàn)兩條DNA帶，即載體條帶(2 999 bp)和目的條帶(450 bp)，空載體對(duì)照只有載體條帶2 999 bp(圖2)。并將PCR和雙酶切鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送往生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)比對(duì)正確，提示pVAX1-LppA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.2 000 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.重組質(zhì)粒pVAX1-LppA；4.PCR對(duì)照；-.空白對(duì)照

M.1 kb-Ⅳ DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.重組質(zhì)粒pVAX1-LppA；4.PCR對(duì)照；5.空載體對(duì)照

2.2 重組質(zhì)粒pVAX1-LppA體外表達(dá)鑒定

RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示pVAX1-LppA轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后，可擴(kuò)增到大小為450 bp目的條帶(圖3)，而空載體對(duì)照組未擴(kuò)增出條帶，提示目的基因轉(zhuǎn)錄mRNA的存在。采用間接免疫熒光方法檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染pVAX1-LppA組可見(jiàn)綠色熒光，空載體對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光，提示構(gòu)建pVAX1-LppA可在MDBK細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)(圖4)。

2.3 免疫小鼠血清抗體檢測(cè)

在免疫重組質(zhì)粒pVAX1-LppA后14 d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)小鼠有任何臨床異?，F(xiàn)象，通過(guò)間接ELISA方法對(duì)采集的不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)。結(jié)果如圖5，pVAX1-LppADNA疫苗組小鼠血清中抗體水平均在免疫后1周顯著提高并在7周內(nèi)保持較高水平，且均顯著高于PBS和空載體對(duì)照組，但不同劑量組間抗體水平無(wú)差異。

字母一致或ns表示差異不顯著(P>0.05)，字母不一致表示差異顯著(P < 0.05)；樣本OD630 nm值≥2.325時(shí)為陽(yáng)性；樣本OD630 nm值<2.325時(shí)為陰性。下圖同

2.4 IL-2、IL-4和IFN-γ分泌水平檢測(cè)

采集不同時(shí)間點(diǎn)的各組小鼠血清樣本，應(yīng)用細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中IL-2、IL-4、IFN-γ細(xì)胞因子含量。結(jié)果如圖6所示，與PBS和空載體pVAX1對(duì)照組相比，免疫重組質(zhì)粒pVAX1-LppA(50、100、150 μg)的小鼠血清中細(xì)胞因子分泌水平均顯著升高，在免疫后第4周達(dá)到巔峰后略有下降，但整體維持在較高水平，重組質(zhì)粒pVAX1-LppA的免疫劑量不同對(duì)細(xì)胞因子分泌水平影響不顯著，提示重組質(zhì)粒pVAX1-LppA可以提高細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)分泌水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。

圖6 小鼠血清中IL-2(A)、IL-4(B)和IFN-γ(C)分泌水平檢測(cè)結(jié)果

2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)

利用MTT比色法檢測(cè)不同時(shí)間各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況，結(jié)果見(jiàn)圖7，在免疫后1周重組質(zhì)粒pVAX1-LppA組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖速度加快，2～6周均顯著高于對(duì)照組，免疫后2周達(dá)到巔峰維持3周后緩慢下降，7周時(shí)仍保持較高水平并顯著高于對(duì)照組，其中pVAX1-LppA(100 μg)組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于其余兩個(gè)劑量組。

圖7 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

2.6 脾T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞)占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果見(jiàn)圖8，PBS組、空載體組、pVAX1-LppA50 μg組、pVAX1-LppA100 μg組、pVAX1-LppA150 μg組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比分別為9.7%、9.8%、12.3%、21.7%、14.9%，CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比分別為5.1%、5.2%、7.8%、8.9%、8.1%，pVAX1-LppA組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，提示pVAX1-LppADNA疫苗可引起免疫反應(yīng)，其中CD4+T細(xì)胞較CD8+T細(xì)胞比重更大。

圖8 免疫小鼠T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞占總細(xì)胞的變化情況

2.7 攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果

人工感染Mmc后，PBS和空載體pVAX1對(duì)照組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降等臨床癥狀判定為發(fā)病，保護(hù)率為0%，免疫pVAX1-LppA(50、100、150 μg)組部分小鼠出現(xiàn)臨床癥狀，保護(hù)率分別為40%、80%、60%，發(fā)病小鼠數(shù)量明顯少于對(duì)照組，其中免疫pVAX1-LppA(100 μg)小鼠保護(hù)率最高為80 %(表1)。取人工感染后各組小鼠的肺進(jìn)行病理切片觀察，結(jié)果如圖9，PBS和空載體pVAX1對(duì)照組肺泡出現(xiàn)融合性病灶，肺泡壁斷裂，肺泡結(jié)構(gòu)退化或消失，滲出大量炎性細(xì)胞；pVAX1-LppA(50、100、150 μg)組癥狀明顯減輕，炎性滲出物減少，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)比較完整。

表1 小鼠Mmc攻毒保護(hù)結(jié)果

3 討 論

絲狀支原體山羊亞種是引起我國(guó)山羊支原體性肺炎的病原之一，傳染性較強(qiáng)，危害嚴(yán)重，給不同品種山羊大規(guī)模養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重的防控挑戰(zhàn)[10]。由于支原體的培養(yǎng)困難，培養(yǎng)周期長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)要求高，導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗研究進(jìn)展緩慢，目前尚未有針對(duì)防控此病原感染的相關(guān)疫苗，所以臨床上養(yǎng)殖戶(hù)們常選用喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等藥物控制該病，但藥物無(wú)法根除病原且只在初次感染有一定作用，發(fā)生耐藥性、藥物殘留等情況也屢見(jiàn)不鮮，因此，為解決目前傳統(tǒng)疫苗研究的困境，急需研制一種安全有效的疫苗[11-12]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，亞單位疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、活載體疫苗等新型疫苗逐漸引領(lǐng)當(dāng)前疫苗研究的新風(fēng)向，較傳統(tǒng)疫苗新型疫苗具有易于構(gòu)建、免疫原性和生物安全穩(wěn)定性更高等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。結(jié)合前期對(duì)MmcLppA基因的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LppA基因N末端的B細(xì)胞表位區(qū)域較大且穩(wěn)定，是優(yōu)勢(shì)抗原表位的潛在區(qū)域，張玲等[15]構(gòu)建LppA重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LppA證明LppA具有良好的免疫原性，因此本研究針對(duì)引起山羊支原體肺炎的主要病原Mmc，基于Mmc的LppA 蛋白N末端基因研制DNA疫苗，并分析其免疫效果。

高水平體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)被認(rèn)為是疫苗介導(dǎo)最有效的免疫反應(yīng)，但不同種類(lèi)疫苗的免疫效果存在差異，滅活疫苗主要激活宿主產(chǎn)生高水平的體液免疫應(yīng)答，基因工程疫苗可同時(shí)刺激機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫[16-17]。IFN-γ和IL-2主要由Th1型細(xì)胞分泌，IFN-γ是細(xì)胞免疫應(yīng)答的標(biāo)志，IL-2是一種T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，參與抗原特異性T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增，促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞大量增殖[18]，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞協(xié)同T細(xì)胞抗原受體激活細(xì)胞免疫應(yīng)[19]，但CD8+T細(xì)胞在某些趨化因子誘導(dǎo)具有抑制作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)pVAX1-LppADNA疫苗免疫小鼠后血清中細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平和CD4+、CD8+T細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比均高于對(duì)照組，且CD4+T細(xì)胞的占比高于CD8+T細(xì)胞，提示pVAX1-LppADNA疫苗對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，并且主要以CD4+T輔助淋巴細(xì)胞為主。IL-4是Th2型細(xì)胞因子，通過(guò)刺激記憶B細(xì)胞增殖、分化成漿細(xì)胞分泌抗體，參與調(diào)控體液免疫[21]，結(jié)果表明在免疫pVAX1-LppADNA疫苗后血清中Mmc LppA特異性抗體水平顯著上升，并與進(jìn)一步檢測(cè)IL-4分泌水平的結(jié)果一致，由此推測(cè)IL-4的表達(dá)增多促進(jìn)了特異性抗體的分泌，提示pVAX1-LppADNA疫苗可以引起體液免疫應(yīng)答。綜上所述，提示pVAX1-LppADNA疫苗可同時(shí)激發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答以防御病原入侵。

攻毒保護(hù)效率也是檢驗(yàn)疫苗免疫效果的重要指標(biāo)，人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠接種pVAX1-LppADNA疫苗后刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答，Mmc感染小鼠后機(jī)體可特異性識(shí)別病原并快速清除，因此感染后不同試驗(yàn)組小鼠癥狀表現(xiàn)不一，所以疫苗免疫組小鼠臨床癥狀和病理?yè)p傷明顯減輕，發(fā)病數(shù)量減少，總體來(lái)看pVAX1-LppADNA疫苗劑量為100 μg的免疫效果最佳，略好于150 μg。一般來(lái)說(shuō)免疫效果與疫苗劑量呈正相關(guān)，本研究結(jié)果中接種劑量100 μg效果卻好于150 μg，可能的原因有幾點(diǎn)：一是免疫的群體數(shù)量還不夠大，結(jié)果存在一定的偏差；二是疫苗的劑量越高，對(duì)小鼠造成的不良反應(yīng)和副作用也隨之增大[22]。研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)大的免疫應(yīng)答可以幫助機(jī)體抵御病原入侵減少損傷[23]，pVAX1-LppADNA疫苗激活的免疫應(yīng)答水平不足以完全抵御侵染，未達(dá)到100%的保護(hù)率，但其引起高水平的特異性抗體也顯示了LppA蛋白良好的免疫原性，疫苗的效果或許與免疫的程序、未使用佐劑等因素有關(guān)，對(duì)免疫途徑、佐劑等進(jìn)行優(yōu)化期望pVAX1-LppADNA疫苗免疫能成為有效防控山羊支原體肺炎的方法。

4 結(jié) 論

Mmc脂蛋白LppA具有良好的免疫原性，重組質(zhì)粒pVAX1-LppA能激活小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)抵御Mmc感染，可作為防控羊支原體肺炎的候選疫苗。