李 洋 ， 閆亞楠 ， 趙春雷 ， 郭 亮 ，3， 高 聰 ，3， 劉立明 ，3， 陳修來 *，3

（1. 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學(xué) 食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

己二酸作為一種重要的脂肪族二元酸， 在食品、醫(yī)藥、塑料和化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1-4]。2004 年， 己二酸被美國能源部認(rèn)定為12 種能利用可再生生物質(zhì)原料生產(chǎn)的高附加值化學(xué)品之一，年產(chǎn)量達(dá)285 萬噸，增長率為4.1%[3-5]。目前，己二酸的生產(chǎn)主要依賴于化學(xué)法，該過程不僅產(chǎn)生大量的溫室氣體，同時(shí)也有較多的副產(chǎn)物，導(dǎo)致己二酸產(chǎn)率較低。 因此，基于細(xì)胞工廠的生物合成法受到越來越多的關(guān)注，即：利用可再生生物質(zhì)原料高效、持續(xù)地合成己二酸[6-8]。

近年來，關(guān)于己二酸的生物合成主要集中在兩個(gè)方面：1）間接發(fā)酵法：將可再生生物質(zhì)原料首先轉(zhuǎn)化為合成己二酸的前體物質(zhì) （順， 順-粘糠酸或D-葡糖二酸），隨后經(jīng)化學(xué)法生成己二酸[3]。 已有研究表明烯醇還原酶可以催化順， 順-粘糠酸生成己二酸，例如，通過構(gòu)建大腸桿菌（Escherichia coli）共培養(yǎng)系統(tǒng)，葡萄糖經(jīng)莽草酸路徑轉(zhuǎn)化為順，順-粘糠酸， 隨后利用透明顫菌的血紅蛋白降低溶氧量，最終在烯醇還原酶的作用下生成27.6 mg/L 己二酸[9]。但是該酶僅在厭氧條件下才能發(fā)揮最大催化效率，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求[9]。 2）直接合成法：乙酰CoA 和琥珀酰 CoA 在 β-酮基己二酰 CoA 硫解酶（PaaJ）、5-羥基脂酰 CoA 還原酶（PaaH1）、烯酰 CoA水化酶（Ech）、反式-烯酰 CoA 還原酶（Ter）、丁酰激酶（Buk1）和磷酸式丁酰轉(zhuǎn)移酶（Ptb）的共同作用下轉(zhuǎn)化為己二酸[10]。例如，通過構(gòu)建己二酸合成路徑并阻斷乙酸、 乳酸等副產(chǎn)物生成， 工程菌株E. coli MB263（ΔsucD）能夠產(chǎn)生 2.5 g/L 己二酸，但是產(chǎn)率僅達(dá)到了理論產(chǎn)率的9.6%[10]。 另外，將源于褐色嗜熱裂孢菌 （Thermobifida fusca） 的逆己二酸降解路徑，在E. coli BL21 中進(jìn)行重構(gòu)與優(yōu)化，最終工程菌株E. coli Mad123146 產(chǎn)生68.0 g/L 己二酸，這是目前所報(bào)道的最高產(chǎn)量（見表1）。然而，由于碳原子損失，己二酸產(chǎn)率僅有0.378 g/g（以甘油質(zhì)量計(jì)）[5]。

表1 代謝工程改造微生物生產(chǎn)己二酸Table 1 Production of adipic acid in the metabolically engineered microorganisms

續(xù)表1

為了進(jìn)一步提高生物法合成己二酸在工業(yè)化生產(chǎn)上的競爭力，開發(fā)高效合成己二酸的微生物細(xì)胞工廠受到越來越多的關(guān)注。 脂肪酸，作為自然界中廣泛存在的可再生原料，具有高效生產(chǎn)高價(jià)值化學(xué)品的潛力：一方面，脂肪酸的使用避免了與可食用糧食作物的競爭，降低了生產(chǎn)成本；另一方面，經(jīng)脂肪酸分解代謝可實(shí)現(xiàn)碳回收率100%， 理論上具有最高的產(chǎn)品產(chǎn)率[11-12]。 例如，通過強(qiáng)化脂肪酸代謝路徑，獲得了一株能夠高效利用棕櫚酸的工程菌株E. coli HP08，3-羥基丙酸的得率達(dá)到了1.56 g/g（以棕櫚酸質(zhì)量計(jì)），遠(yuǎn)高于其他原料[12]。然而，利用脂肪酸生產(chǎn)己二酸的研究較少，主要原因在于缺乏特異性催化中鏈脂肪酸的細(xì)胞色素P450 還原酶， 代謝輔因子不平衡，底物或產(chǎn)物抑制嚴(yán)重等[13-14]。 因此，構(gòu)建一種能夠高效利用脂肪酸生產(chǎn)己二酸的微生物細(xì)胞工廠，有助于實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的雙收益。

為了開發(fā)能夠利用脂肪酸合成己二酸的細(xì)胞工廠，作者首先結(jié)合β-氧化路徑和ω-氧化路徑，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一條新型的己二酸合成路徑； 其次，采用融合蛋白、RBS 組合優(yōu)化、 基因敲除等策略優(yōu)化了己二酸合成路徑；最終，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，提高了己二酸的積累量，為利用脂肪酸生產(chǎn)其他高價(jià)值化學(xué)品奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 作者使用的大腸桿菌E. coli JM109 和E. coli ATCC 8739 分別用于表達(dá)載體的構(gòu)建和生產(chǎn)菌株，其中所使用的基因工程菌和重組質(zhì)粒分別見表2 和表3。

表2 研究所使用的菌種Table 2 Strains used in this study

表3 研究所使用的重組質(zhì)粒Table 3 Plasmids used in this study

續(xù)表3

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR 擴(kuò)增儀、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔儀、核酸電泳儀：美國Bio-rad 公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)： 日本島津公司產(chǎn)品；SBA 生物傳感器：山東科學(xué)院生物研究所產(chǎn)品；精密pH 計(jì)：瑞士METTLER 公司產(chǎn)品；XD-650D 超聲破碎儀：南京先歐儀器制造有限公司產(chǎn)品；Invitrogen iBright智能成像系統(tǒng)： 賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；5804R 型高速離心機(jī)： 德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；CHB-202 恒溫金屬?。?日本 Bioer Technology 公司產(chǎn)品；氣相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品。

限制性內(nèi)切酶、Prime Star 高保真酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、DNA marker：購自 TaKaRa（大連）有限公司；一步同源重組酶：購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、鹽酸大觀霉素、阿拉伯糖、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）：購自生工生物工程（上海）公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒：購自天根公司；棕櫚酸、正己酸、己二酸、Brij 58、N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PCR 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 大腸桿菌的前培養(yǎng)在LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行，TB 培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)正己酸和己二酸， 而己二酸的發(fā)酵生產(chǎn)在M9 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行。

LB 培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L、蛋白胨 10 g/L、NaCl 10 g/L。 LB 固體培養(yǎng)基額外添加20 g/L 的瓊脂粉。

TB 培養(yǎng)基：酵母粉 24 g/L、胰蛋白胨 12 g/L、甘油 4 g/L、K2HPO42.31 g/L、KH2PO4·3H2O 16.42 g/L。

M9 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 15.11 g/L、KH2PO43 g/L、NH4Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、 微量元素液1 mL/L 和10 g/L 葡萄糖或棕櫚酸。

微量元素液：FeCl3·12H2O 2.4 g/L、CoCl2·6H2O 0.3 g/L、CuCl20.15 g/L、ZnCl2·4H2O 0.15 g/L、NaMnO40.3 g/L、H3BO30.075 g/L、MnCl2·4H2O 0.5 g/L， 溶于0.1 mol/L HCl。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 所有表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建均通過標(biāo)準(zhǔn)分子克隆操作和吉布森組裝法，其中一步同源重組法是根據(jù)目的片段與表達(dá)載體之間具有相同序列連接的方法。 采用的 fadL、fadD、fadE、fadB、fadA 基因來源于 E. coli MG1655，而來自惡臭假單胞菌 （Pseudomonas putida） 的 alkB、alkG、alkT基因和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp. SE19）的chnD和chnE 基因在蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化和合成。 此外，輔因子再生系統(tǒng)中來源于博伊假絲酵母（Candida boidinill）的fdh 基因和大腸桿菌本源的nox 基因也進(jìn)行密碼子優(yōu)化和合成。所有引物在蘇州金唯智生物科技有限公司合成（見表4），同時(shí)重組質(zhì)粒的Sanger 測(cè)序在天霖生物科技無錫有限公司進(jìn)行。

表4 研究所使用的引物Table 4 Primers used in this study

續(xù)表4

以E. coli MG1655 基因組為模板， 用引物對(duì)fadLEc-S/A 和 ydiIEc-S/A 分 別擴(kuò)增 fadL 和 ydiI 基因， 經(jīng)同源重組連接至載體ptet 的EcoR I/Hind III位點(diǎn)產(chǎn)生質(zhì)粒ptet-YL1。 隨后，用引物對(duì)fdhBc-S/A和noxEc-S/A 分別擴(kuò)增目的片段fdh 和nox 并連接至質(zhì)粒ptet-YL1 的Bgl II/Hind III 位點(diǎn)， 得到表達(dá)載體ptet-YL2。

以E. coli MG1655 基因組為模板， 用引物對(duì)fadDEc-S/A 擴(kuò)增 fadD 片段并連接至質(zhì)粒 pEM 的BamH I/Sac I 位點(diǎn)。 與此同時(shí)，經(jīng)引物對(duì)fadAEc-S/A和fadBEc-S/A 擴(kuò)增得到的目的片段fadA 和fadB 連接至pEM 得到pEM-fadB-fadA，隨后酶切連接產(chǎn)生pEM-fadD-fadB-fadA。 最后， 把引物對(duì) fadEEc-S/A擴(kuò)增的fadE 片段連接至pEM-fadD-fadB-fadA 的Spe I/Pst I 位點(diǎn)， 產(chǎn)生表達(dá)載體 pEM-YL1。 除此之外， 含有片段FadA 和FadB 的融合蛋白通過“GGT GGT GGT TCT”形成的Linker 連接，得到載體pEMYL2 和 pEM-YL3。

以質(zhì)粒 pET28a-YL1 和 pET28a-YL2 為模板，分別用引物對(duì)alkBPpu-S/A 和alkGPpu-S/A 擴(kuò)增片段alkB 和 alkG 并連接至質(zhì)粒 pEtac 的 EcoR I/Sal I 位點(diǎn)。 隨后，chnD 和 chnE 基因連接至 pEtac-alkB-alkG 的 Sal I/Hind III 位點(diǎn)形成 pEtac-alkB-alkG-chnD-chnE。最后，把引物對(duì)alkTPpu-S/A 擴(kuò)增的alkT基因連接至pEtac-alkB-alkG-chnD-chnE 的Spe I/Sal I 位點(diǎn)，獲得表達(dá)載體 pEtac-YL1。 另外，表達(dá)載體pEtac-YL2/3/4/5 采用相同的方法構(gòu)建。

E. coli ATCC 8739 的轉(zhuǎn)化采用電擊轉(zhuǎn)化的方式，隨后涂布于含有相應(yīng)抗性的篩選平板，挑選轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，產(chǎn)生一系列工程菌株生產(chǎn)正己酸和己二酸。 除此之外，從基因組上敲除fadR 基因采用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)， 具體方法參照 Zhao 等的研究[5]。

1.2.2 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)己二酸 將前培養(yǎng)的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至150 mL TB 培養(yǎng)基培養(yǎng)， 當(dāng) OD600達(dá)0.6~0.8 時(shí)加入 0.43 mol/L IPTG 或 400 ng/mL 無水四環(huán)素誘導(dǎo)路徑酶的表達(dá)，并將溫度調(diào)至30 ℃培養(yǎng)12 h。隨后，培養(yǎng)液于4 ℃下以6 000 r/min 離心10 min，收集菌體并保存至-40 ℃冰箱作為生物催化劑。

對(duì)于棕櫚酸降解生成正己酸， 轉(zhuǎn)化體系包括39.1 mmol/L 棕櫚酸、10.0 mmol/L ATP、10.0 mmol/L FAD、10.0 mmol/L NAD+、10.0 mmol/L CoA-SH、39.1 mmol/L MgSO4·7H2O， 用 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 7.0）定容至 10 mL，菌體量為 30 g/L，反應(yīng)條件為30 ℃下3 d。 發(fā)酵液用于氣質(zhì)測(cè)定。

對(duì)于正己酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)己二酸， 轉(zhuǎn)化體系包括86.0 mmol/L 正己酸、10.0 mmol/L NAD+、8.6 mmol/L FeSO4·7H2O，用 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 7.0）定容至10 mL，菌體量為30 g/L，反應(yīng)條件為30 ℃下3 d。 發(fā)酵液用于氣質(zhì)測(cè)定。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)己二酸 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的方法包括發(fā)酵法和轉(zhuǎn)化法：1）發(fā)酵法：工程菌株培養(yǎng)于含有葡萄糖的M9 培養(yǎng)基中， 當(dāng)葡萄糖消耗完后添加10 g/L 棕櫚酸，同時(shí)每24 h 補(bǔ)加10 g/L葡萄糖促進(jìn)細(xì)胞生長。 2）轉(zhuǎn)化法：將前培養(yǎng)的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至50 mL M9 培養(yǎng)基中， 當(dāng)10 g/L 葡萄糖消耗完后，在4 ℃下以4 000 r/min 離心5 min 收集菌體，并用20 mL PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞兩次并轉(zhuǎn)接至含有10 g/L 棕櫚酸的50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中。整個(gè)發(fā)酵過程添加碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。

1.3 分析方法

細(xì)胞密度通過測(cè)定600 nm 處的OD 值來表示，葡萄糖的測(cè)定通過生物傳感分析儀，而棕櫚酸和己二酸用氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。

葡萄糖的測(cè)定： 利用SBA-40E 生物傳感分析儀測(cè)定，發(fā)酵液稀釋10 倍后直接進(jìn)樣，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到發(fā)酵液中的葡萄糖含量。

棕櫚酸、正己酸和己二酸的測(cè)定：利用氣相色譜儀測(cè)定， 取2 mL 發(fā)酵液于12 000 r/min 離心10 min， 將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中， 隨后用2 mL乙酸乙酯萃取， 取1 mL 有機(jī)相轉(zhuǎn)移至試管并用氮?dú)獯蹈伞?對(duì)于正己酸的測(cè)定：向試管中加入5 mL 含甲醇、硫酸、三氯甲烷（體積比 30∶3∶1）的混合液，70℃反應(yīng)1 h，冷卻后加入1 mL 超純水，隨后用1 mL正己烷萃取進(jìn)行檢測(cè)。 對(duì)于棕櫚酸和己二酸的測(cè)定：向試管中加入200 μL 吡啶溶解殘留物后，加入200 μL N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷混合液 （體積比 99∶1），65 ℃反應(yīng) 30 min。反應(yīng)液用氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL 正己烷進(jìn)行氣質(zhì)測(cè)定。 氣相檢測(cè)條件：初始溫度50 ℃，保持1 min；以8 ℃/min 速度升高至 180 ℃；以 10 ℃/min 速度升高至 240 ℃，保持 5 min。 載氣為氦氣，流量 1 mL/min，進(jìn)樣量 1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 己二酸合成路徑的設(shè)計(jì)

為了構(gòu)建高效的己二酸生產(chǎn)菌株，以棕櫚酸為底物設(shè)計(jì)了一條新型的己二酸合成路徑，該路徑主要包括兩個(gè)模塊，1）上游模塊：棕櫚酸經(jīng)β-氧化路徑降解為正己酸， 該路徑主要包括6 個(gè)關(guān)鍵酶，分別是長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FadL）、脂酰-CoA 合成酶（FadD）、脂酰-CoA 脫氫酶（FadE）、脂肪酸氧化酶復(fù)合體α 亞基（FadB）、脂肪酸氧化酶復(fù)合體β 亞基（FadA）和硫酯酶（YdiI）；2）下游模塊：正己酸經(jīng) ω-氧化路徑生成己二酸， 該路徑主要包括5 個(gè)關(guān)鍵酶，分別是惡臭假單胞菌（P. putida）的烷烴-1-單加氧酶（AlkB）、紅素氧還蛋白（AlkG）、紅素氧化蛋白-NAD+還原酶（AlkT）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.SE19）的6-羥基己酸脫氫酶（ChnD）和6-氧代己酸脫氫酶（ChnE）（見圖 1）。 理論上，該路徑可實(shí)現(xiàn) 1 mol 棕櫚酸到1 mol 己二酸的轉(zhuǎn)化，不存在碳損失，回收率達(dá)100%。

圖1 重構(gòu)大腸桿菌脂肪酸代謝合成己二酸Fig. 1 Establishing the adipic acid production platform by rewiring fatty acids catabolism in E. coli

2.2 己二酸上游合成路徑的構(gòu)建與強(qiáng)化

首先，通過對(duì)β-氧化路徑進(jìn)行改造，提高棕櫚酸到正己酸的轉(zhuǎn)化速率（見圖2（a））。代謝改造策略主要包括：1）將fadL 和ydiI 基因連接至低拷貝數(shù)表達(dá)載體 ptet；2）將 fadD、fadE、fadB 和 fadA 基因連接至中拷貝數(shù)表達(dá)載體pEM；3） 將編碼脂酰-CoA 脫氫酶基因的起始密碼子“TTG”替換為“ATG”。 SDSPAGE 驗(yàn)證表明，上述所有蛋白質(zhì)均已成功表達(dá)。以棕櫚酸為底物，借助全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，獲得了0.67 g/L 正己酸， 而對(duì)照菌株并不能轉(zhuǎn)化棕櫚酸生產(chǎn)正己酸（見圖 2（b））。 上述結(jié)果表明，強(qiáng)化 β-氧化路徑可促進(jìn)棕櫚酸轉(zhuǎn)化為正己酸。

其次，由于β-氧化路徑涉及多種輔因子，測(cè)試了不同濃度FAD 對(duì)正己酸產(chǎn)量的影響。隨著輔因子FAD 濃度的減少，正己酸產(chǎn)量也隨之降低。 上述結(jié)果表明， 胞內(nèi)輔因子FAD 的濃度是影響β-氧化降解路徑的關(guān)鍵因素之一。 為了進(jìn)一步提高正己酸產(chǎn)量，構(gòu)建了輔因子循環(huán)再生系統(tǒng)[22]，在該系統(tǒng)中FADH2經(jīng)甲酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為FAD， 與此同時(shí)NADH 被NADH 氧化酶轉(zhuǎn)化生成NAD+。 經(jīng)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化表明，菌株 AA0107 可以產(chǎn)生 0.77 g/L 正己酸， 與菌株AA0106 相比提高了 14.93 %（見圖 2（c））。 綜上所述，提高胞內(nèi)的輔因子含量可以促進(jìn)正己酸的合成。

圖2 強(qiáng)化β-氧化路徑提高正己酸的合成Fig. 2 Enhancement of β-oxidation degradation pathway for improving the yield of hexanoic acid

另外，由于FadB 和FadA 分別屬于脂肪酸氧化酶復(fù)合體的兩個(gè)亞基，通過構(gòu)建FadB 和FadA 的融合蛋白，可以提高底物的傳輸效率，進(jìn)而改善正己酸產(chǎn)量。 基于此，構(gòu)建了兩種融合蛋白FadB-FadA和 FadA-FadB，獲得菌株 AA0108 和 AA0109。 經(jīng)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化表明， 工程菌株AA0108 可以產(chǎn)生0.13 g/L正己酸，與菌株AA0107 相比降低了80.60%。 另外，工程菌株AA0109 沒有檢測(cè)到正己酸產(chǎn)生。 上述結(jié)果表明，構(gòu)建融合蛋白并不能有效促進(jìn)正己酸的生成，可能是由于融合蛋白影響了單個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能[23]。

2.3 己二酸下游合成路徑的重構(gòu)與優(yōu)化

首先，通過異源構(gòu)建ω-氧化路徑，促進(jìn)正己酸轉(zhuǎn)化為己二酸。 alkB、alkG、alkT、chnD 和 chnE 基因連接至中拷貝數(shù)載體pEtac， 經(jīng)SDS-PAGE 驗(yàn)證所有基因均已成功表達(dá)。 通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化表明，10 g/L正己酸能被轉(zhuǎn)化生成0.61 g/L 己二酸（見圖3（e））。上述結(jié)果表明， 異源引入ω-氧化路徑可以氧化正己酸形成己二酸。 但是，己二酸的合成效率還需要進(jìn)一步提高，主要原因可能在于異源基因表達(dá)不平衡，導(dǎo)致中間代謝物大量積累，從而影響細(xì)胞的生產(chǎn)性能。

基于上述分析，模塊化優(yōu)化了ω-氧化路徑。 首先， 將ω-氧化路徑分為羥化模塊 （包括alkB、alkG和 alkT 基因） 和氧化模塊 （包括 chnD 和 chnE 基因）。 其次，以綠色熒光蛋白（GFP）為報(bào)告蛋白，將RBS30、RBS34 和RBS32 強(qiáng)度分別作為高、中和低3種水平。 再次，借助不同強(qiáng)度的RBS，構(gòu)建5 種基因表達(dá)水平的羥化模塊和氧化模塊組合（見圖3（a）~圖 3（d））。 最后，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，下調(diào)羥化模塊降低了己二酸的產(chǎn)量，僅有0.56 g/L；上調(diào)羥化模塊提高己二酸的產(chǎn)量至0.69 g/L， 與菌株AA0201相比提高了13.11%。 另外，下調(diào)氧化模塊提高了己二酸的產(chǎn)量，達(dá)到0.76 g/L，與菌株AA0201 相比提高了24.59%；上調(diào)氧化模塊降低了己二酸產(chǎn)量（見圖3（e））。上述結(jié)果表明，通過上調(diào)羥化模塊和下調(diào)氧化模塊，優(yōu)化了ω-氧化路徑，有效促進(jìn)了己二酸的合成。

2.4 己二酸合成路徑的組裝與應(yīng)用

為了實(shí)現(xiàn)棕櫚酸到己二酸的轉(zhuǎn)化，將上述構(gòu)建的最適上游模塊和下游模塊進(jìn)行組裝，獲得工程菌株 AA0301。 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果表明， 工程菌株AA0301 能夠轉(zhuǎn)化棕櫚酸產(chǎn)生57.0 mg/L 己二酸（見圖4（a））。為了增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)脂肪酸的利用能力，敲除了編碼脂肪酸代謝調(diào)控蛋白的fadR 基因，獲得工程菌株AA0303。 同時(shí)，將最優(yōu)的上游模塊和下游模塊導(dǎo)入菌株AA0303 中，獲得工程菌株AA0304。隨后，采用兩種發(fā)酵策略進(jìn)一步提高己二酸產(chǎn)量，1）發(fā)酵法：首先將工程菌株AA0304 培養(yǎng)在M9 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至一定時(shí)間后直接加入棕櫚酸，在發(fā)酵過程中添加葡萄糖用于細(xì)胞生長；2）轉(zhuǎn)化法：首先將工程菌株AA0304 培養(yǎng)在以葡萄糖為碳源的M9 培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)至一定時(shí)間后收集菌體，轉(zhuǎn)接至以棕櫚酸為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中。 研究發(fā)現(xiàn)，采用轉(zhuǎn)化法更有利于己二酸積累，產(chǎn)量達(dá)到了110.2 mg/L，與發(fā)酵法相比提高了 93.33%（見圖 4（b）~圖 4（c））。上述結(jié)果表明，通過結(jié)合β-氧化路徑和ω-氧化路徑，棕櫚酸能夠有效轉(zhuǎn)化為己二酸。

圖4 利用棕櫚酸發(fā)酵生產(chǎn)己二酸Fig. 4 Production of adipic acid by palmitic acid fermentation

由于高質(zhì)量濃度的棕櫚酸會(huì)附著在細(xì)胞膜表面，降低細(xì)胞呼吸速率[24]，因此進(jìn)一步分析了分批添加棕櫚酸對(duì)己二酸產(chǎn)量的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸的分批添加，使得己二酸產(chǎn)量提高到了1.32 g/L，與直接添加棕櫚酸相比提高了11.98 倍。 上述結(jié)果表明，分批添加棕櫚酸，降低了其對(duì)細(xì)胞的毒性作用，改善了細(xì)胞生長狀態(tài)，從而促進(jìn)了己二酸生產(chǎn)。

3 討 論

己二酸合成新路徑有助于實(shí)現(xiàn)更高的己二酸得率。 目前，己二酸的合成路徑主要包括：順，順-粘糠酸路徑、D-葡糖二酸路徑、逆己二酸降解路徑、逆β-氧化路徑和 ω-氧化路徑等[4，25-28]。 上述路徑獲得的己二酸產(chǎn)量較低， 原因主要包括以下3 個(gè)方面：1）丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA 會(huì)釋放二氧化碳，降低己二酸產(chǎn)率；2）己二酸的合成路徑較長，導(dǎo)致了副產(chǎn)物積累；3）細(xì)胞生長與己二酸合成之間競爭代謝流。 然而，作者構(gòu)建的己二酸合成路徑具有更多的優(yōu)勢(shì)，一方面，脂肪酸不僅能通過分解代謝路徑生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)品，而且釋放的乙酰CoA 可以促進(jìn)細(xì)胞生長，從而避免了細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成之間的代謝流競爭；另一方面，作者設(shè)計(jì)的己二酸合成路徑能夠?qū)崿F(xiàn)更高的理論得率。 以往所報(bào)道的己二酸合成路徑均以葡萄糖或甘油為底物，己二酸理論得率為33%~67%。 該研究中己二酸合成路徑卻能夠?qū)崿F(xiàn)100%的理論得率，遠(yuǎn)高于其他合成路徑[1，5，26]。 因此，以脂肪酸為基礎(chǔ)的合成路徑具有較高的產(chǎn)品得率和較低的原料成本，是一種潛在的可替代傳統(tǒng)化學(xué)法合成己二酸的方法。

脂肪酸利用型菌株的開發(fā)不僅拓展了微生物的底物譜，而且有助于促進(jìn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。 近年來，隨著代謝工程、合成生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向廉價(jià)原料的利用， 例如蔗糖、果糖、木質(zhì)纖維素、粗甘油、廢棄食用油等[14，29-33]。目前，關(guān)于己二酸的生物法合成，主要以葡萄糖或甘油為原料，產(chǎn)量相對(duì)比較低。 脂肪酸作為自然界中廣泛存在的廉價(jià)原料，具有高效生產(chǎn)高附加值化學(xué)品的潛力，主要原因在于：1）利用脂肪酸具有較高的碳原子經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有利于提高己二酸得率；2）利用脂肪酸可避免與可食用農(nóng)作物的競爭，有利于降低生產(chǎn)成本；3）利用脂肪酸可解決食品廢棄物和環(huán)境污染的問題。因此，作者以脂肪酸為原料，通過結(jié)合β-氧化路徑和ω-氧化路徑設(shè)計(jì)、 構(gòu)建和優(yōu)化己二酸合成路徑，促使棕櫚酸轉(zhuǎn)化生成己二酸，為回收和再利用食品廢棄物提供了可能。 另外，利用廉價(jià)原料合成己二酸，為實(shí)現(xiàn)低成本和可持續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新的道路。

4 結(jié) 語

結(jié)合β-氧化路徑和ω-氧化路徑， 設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一條以脂肪酸為底物合成己二酸的新路徑。 在此基礎(chǔ)上，借助系統(tǒng)代謝工程策略，優(yōu)化了己二酸合成路徑。 此外，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，提高了己二酸的產(chǎn)量。最終，工程菌株E. coli AA0304 能夠產(chǎn)生己二酸1.32 g/L。 為利用脂肪酸合成其他高價(jià)值化學(xué)品奠定了良好的基礎(chǔ)。