林培捷 ， 陳柏雄 ， 陳樂濤 ， 葉志偉 ， 魏 韜 ，鄭倩望 ， 林俊芳 ， 郭麗瓊 *

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510640；2. 廣東省微生態(tài)制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510640）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），俗稱北冬蟲夏草、蟲草花、迷力菌[1]等，在分類學上屬于子囊菌亞門、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是我國最早實現(xiàn)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的蟲生真菌。 蛹蟲草營養(yǎng)豐富、味道鮮美，于2009 年被批準為新資源食品。 蟲草素（3’-脫氧腺苷）是蛹蟲草的核心生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[2]、增強免疫力[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]等多種生物活性功能。 蛹蟲草子實體的蟲草素含量為0.5~5.1 mg/g[6]，不同菌株之間的蟲草素含量差異很大且蛹蟲草菌株較易退化[7]，較多菌株的蟲草素豐度和子實體產(chǎn)量由于傳代逐漸降低。 因此，及時培育篩選出具有高產(chǎn)蟲草素的優(yōu)質(zhì)蛹蟲草新品種以保證蛹蟲草產(chǎn)業(yè)的可續(xù)性發(fā)展是非常必要的。

許多技術已運用于蛹蟲草新品種的選育，如原生質(zhì)體融合[8]、單孢雜交育種[9]和誘變育種[10]。然而誘變育種存在刺激要求不明確、突變率低、萌發(fā)困難等缺點[11]。此外，食用菌誘變材料一般為菌絲體和孢子懸液，由于菌絲體為多細胞，孢子有細胞壁保護，都不適宜誘變[12]；而對于原生質(zhì)體融合，制備的原生質(zhì)體失去細胞壁的保護，突變頻率大大提高[13]。融合后的菌株可能已發(fā)生突變， 且該育種較為不穩(wěn)定。單孢雜交育種是通過模仿蛹蟲草在自然界中的雜交，使不同配型的孢子菌絲形成雜交帶，使其菌絲扭結進而形成異核體，達到基因交流，從而直觀便捷地選育蛹蟲草新品種。 該育種方法能夠有目的性地將菌株的親本進行雜交，篩選目標菌株，但該方法由于缺乏篩選標記，工作量極大。 蛹蟲草是典型的二級性異宗配合真菌，含有相互不同源的兩個交配型基因 MAT1-1 和 MAT1-2[14-15]，交配型基因MAT1-1 序列中 α-Box （Genbank ID：AB124614）和MAT1-2 序列中 HMG-Box（Genbank ID：AB124626）具有高度保守性[16]，所以這兩個序列 MATα 和MATHMG 被用作雜交育種的分子標記。

蛹蟲草的子囊孢子是細胞經(jīng)過核融合和減數(shù)分裂后產(chǎn)生的有性孢子，這一過程蛹蟲草的基因產(chǎn)生了遺傳重組、突變、缺失等變異，其子代性狀出現(xiàn)分化，表型更加豐富，不同子實體或同一子實體產(chǎn)生的子囊孢子菌株在菌落生物學性狀上都存在差異[17]。 這種差異可為蛹蟲草通過子囊孢子間進行雜交選育改善親本優(yōu)良性狀和提高雜交種的豐富性提供親本[18]。 作者選用高產(chǎn)子實體的蛹蟲草ZGCM菌株和高產(chǎn)蟲草素的CM17 菌株作為親本， 以期通過雜交獲得高產(chǎn)子實體且高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草新菌株。兩親本菌株ZGCM 和CM17，前者經(jīng)過栽培產(chǎn)生子實體后分離單孢子囊孢子作為親本，后者不能正常形成子實體無法產(chǎn)子囊孢子，因而從菌絲體中分離得到單孢無性分生孢子作為親本。采用PCR 技術對ZGCM 子囊孢子菌株進行MAT 基因型鑒定，獲取僅含MAT1-1 基因型的ZGCM 子囊孢子菌株；用同樣的方法對CM17 分生孢子進行MAT 基因型鑒定獲得僅含MAT1-2 基因型的分生孢子菌株。 將這兩種不同交配型基因的菌株進行雜交，并對雜交后的菌株進一步鑒定，期望選育出能保持兩種親本優(yōu)良性狀的新菌株。 同時，建立一個高效快速的蛹蟲草雜交育種方案。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

蛹蟲草ZGCM 菌株：購于山東洲工生物科技有限公司；蛹蟲草CM17 菌株：購于山東高港食用菌有限公司；立式顯微鏡：購于麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；熒光顯微鏡：購于徠卡顯微系統(tǒng)公司。

1.2 供試試劑與培養(yǎng)基

細胞裂解緩沖液：Tris 0.121 5 g、NaCl 0.073 g、EDTA 0.036 5 g、SDS 0.025 g， 蒸餾水定容至 50 mL，pH 為 8.0，通過 0.22 μm 濾膜除菌。

洗滌緩沖液：Tris 0.060 5 g、Tween20 50 μL，蒸餾水定容至 50 mL，pH 8.0，通過 0.22 μm 濾膜除菌。

PDB 培養(yǎng)基： 馬鈴薯 200 g、 葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g， 自來水定容至 1 000 mL，自然 pH，滅菌（121 ℃、30 min）。

PDA 培養(yǎng)基：PDB 培養(yǎng)基中加入 20.0 g 瓊脂，自來水定容至 1 000 mL，自然pH，滅菌（121 ℃、30 min）。

大米培養(yǎng)基：大米20.0 g（粒度10 目）放入一個組培瓶并加入30 mL 營養(yǎng)液。 營養(yǎng)液的配方為：葡萄糖 20 g、MgSO41.5 g、KH2PO43 g、 蠶蛹粉 6 g、蛋白胨6 g、維生素B110 mg，純水定容至1 000 mL，自然 pH，滅菌（121 ℃、30 min）。

1.3 蛹蟲草單孢分離

1.3.1 單子囊孢子分離及菌株培養(yǎng) 將已栽培好的蛹蟲草ZGCM 進行子囊孢子分離。 準備1.5 mL離心管，管內(nèi)加1 mL 蒸餾水，在121 ℃滅菌20 min后備用。 然后用鑷子夾取蟲草子實體頂部，涂抹一點凡士林，粘貼在離心管蓋，倒懸在無菌水上方，閉蓋于25 ℃光照條件下培養(yǎng)36 h， 誘發(fā)蟲草子實體上的孢子彈落水中形成孢子懸浮液。 將孢子液涂布于事先倒好的PDA 平板上，培養(yǎng)4 d，最后將平板上長出來的孢子菌絲用立式顯微鏡單獨挑出接種在PDA 斜面上于25 ℃避光培養(yǎng)15 d， 獲得蛹蟲草子囊孢子菌株。

1.3.2 蛹蟲草子囊孢子菌絲熒光染色 為確定蛹蟲草的子囊孢子菌絲的菌核，需將蛹蟲草子囊孢子菌絲進行熒光染色，染色方法在Lou 等方法上略有修改[19]。 將斜面上的菌株接種至PDA 平板后，分別在平板各方位插入蓋玻片，25 ℃避光培養(yǎng)， 待菌絲布滿蓋玻片后取出放到甲醛溶液 （體積分數(shù)10%）浸泡固定1 h。 取出蓋玻片自然晾干， 然后分別加100 μL FB28（2.5 μg/mL）與 100 μL DAPI（5 μg/mL）染色約30 min。染色結束后，用10×PBS 泡洗約1 min。泡洗結束后，蓋到含有甘油、10×PBS（各 50 μL）的載玻片上，然后用熒光顯微鏡進行觀察。

1.3.3 單分生孢子分離及菌株培養(yǎng) 蛹蟲草CM17菌株接種于PDA 斜面于25 ℃避光條件下培養(yǎng)5 d。挑取菌株接種于裝有100 mL PDB 培養(yǎng)基的錐形瓶中，于 25 ℃避光搖瓶振蕩（150 r/min）培養(yǎng) 8 d。 用滅菌后的脫脂棉填充過濾器，在無菌條件下將發(fā)酵液過濾，濾取孢子，用顯微鏡進行鏡檢，確定無殘留菌絲片段后，將孢子菌懸液用無菌生理鹽水適當稀釋。然后將稀釋的孢子液涂布于事先倒好的PDA 平板上，培養(yǎng)4 d，最后將平板上長出來的孢子菌絲，用立式顯微鏡單獨挑出接種在PDA 斜面于25 ℃避光培養(yǎng)15 d，獲得蛹蟲草分生孢子菌株。

1.4 蛹蟲草單孢子菌株基因標記

1.4.1 基因快速提取 基因快速提取的方法在Zou等的方法上略有修改[20]。將斜面上的菌株接種于50 mL PDB 培養(yǎng)基中，25 ℃避光搖瓶振蕩 （150 r/min）培養(yǎng)4 d。用剪過的大槍頭吸取2 mL 菌液于離心管中，8 000 r/min 離心2 min。 去除離心管中的上清液，加入1 mL ddH2O，吹打均勻，8 000 r/min 離心2 min，去除上清液。 向 2 mL 離心管中加入 500 μL 細胞裂解緩沖液，2~3 個玻璃珠，渦旋振動約8 s。將纖維素試紙切成44 mm×2 mm 的矩形，其中40 mm×2 mm 為疏水區(qū)，4 mm×2 mm 為纖維素與核酸的結合區(qū)，將矩形纖維素試紙的核酸結合區(qū)浸入細胞裂解液中結合核酸，上下浸泡5~6 次。 然后，浸入提前分裝好的洗滌緩沖液離心管中，上下浸泡5~6 次。 最后， 直接浸入PCR 反應體系中， 上下浸泡5~6 次。PCR 體系包括 2×PCRMix12.5 μL、 引物各 1 μL、ddH2O 10 μL。

1.4.2 PCR 分析 通過PCR 分析 MAT 基因的情況， 其中 PCR 的引物分為 MATα-F（GAGCCTACT ATGGAACCC）、MATα-R（CAGGACTGATACCAGCA AA）、MATHMG-F（GCATCAACCCATTTGTGAAAGT TCT）和 MATHMG-R（CCTGTCATAATGGTGCTGT）[21]。PCR 的參數(shù)為：94 ℃運行 3 min，然后 94 ℃下 30 s，60 ℃下 30 s，72 ℃下 44 s，共 25 個循環(huán)，之后 72 ℃下 5 min，4 ℃下 40 min。 PCR 體系通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.5 蛹蟲草單孢菌株對峙培養(yǎng)

根據(jù)上述基因型的鑒定結果，選擇含有MAT1-1 型的 ZGCM 子囊孢子和MAT1-2 型的CM17 分生孢子，兩兩配對。 將大米培養(yǎng)基劃分成兩個區(qū)域，分別將兩種類型的孢子菌株接種于兩個區(qū)域，避光條件下培養(yǎng)5 d 后，光照條件下培養(yǎng)30 d，誘導其長出子實體。 挑取中間雜交的子實體接種于PDA 平板上，25 ℃避光條件下培養(yǎng)15 d，得到假定雜交菌株。

1.6 假定雜交種的鑒定

1.6.1 假定雜交種的基因鑒定 將1.5 中在PDA平板上正常生長的菌株切塊接種至50 mL PDB 培養(yǎng)基中，25 ℃避光搖瓶振蕩（150 r/min）培養(yǎng) 4 d。然后運用1.4 的方法，檢測假定雜交種的MAT 基因。

1.6.2 熒光染色菌核鑒定 為進一步確定雜交菌株的特性，將雜交菌株的菌絲進行熒光染色，方法同1.3.2。

1.7 雜交種及親本生物學特性鑒定

1.7.1 蛹蟲草子實體的栽培 為了觀察雜交菌株的栽培情況，將蛹蟲草親本和雜交種接種至PDB 培養(yǎng)基，25 ℃避光搖瓶（150 r/min）振蕩培養(yǎng) 4 d，獲得液體菌種。 取5 mL 液體菌種接種至大米培養(yǎng)基于25 ℃避光培養(yǎng)5 d，然后25 ℃光照培養(yǎng)60 d，觀察其生長情況。 之后將栽培好的蛹蟲草雜交菌株中的子實體和基質(zhì)于烘箱中烘干36 h，并對烘干樣品進行稱重。

1.7.2 蛹蟲草子實體及基質(zhì)的蟲草素測定 將1.7.1 中已烘干的子實體及基質(zhì)研磨后過60 目篩網(wǎng)，獲得子實體和基質(zhì)的粉末樣品。分別稱取0.02 g蛹蟲草子實體粉末和0.04 g 蛹蟲草基質(zhì)粉末放入10 mL 離心管， 加入 2 mL 超純水。 置于 95 ℃水浴2 h，轉移到超聲儀水浴振蕩1 h，重復3 次，使蟲草素被充分提取。劇烈振蕩渦旋后將懸浮液轉移至2 mL離心管中，在25 ℃下以10 000 r/min 離心10 min，去除沉淀， 取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾于進樣瓶中。 之后進行 HPLC 測量，HPLC 的分析條件為：色譜柱采用AQ-C18，流動相為85% ddH2O 和15%甲醇（均為體積分數(shù)），流量 1 mL/min，檢測波長260 n m， 進樣體積20 μL， 蟲草素標準曲線為 0.025~0.625 μg/mL，柱溫 30 ℃，出峰時間 14~15 min。通過標準曲線對實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草的單孢分離

蛹蟲草的單孢分離是蛹蟲草雜交育種的重要步驟。 蛹蟲草ZGCM 的子囊孢子被適當稀釋后涂布于 PDA 平板上（見圖 1（a）），然后從 PDA 平板上挑取孢子菌絲接種至斜面（見圖1（b））。 經(jīng)過培養(yǎng)后，子囊孢子菌株間性狀存在差異，子囊孢子菌株的菌絲有的顏色偏黃，有的為白色，且菌絲厚實程度也有差異，說明蛹蟲草子囊孢子基因重組后產(chǎn)生性狀分離。 為了進一步確定蛹蟲草子囊孢子的菌核情況，選取蛹蟲草的子囊孢子菌絲進行熒光染色（見圖1（c））。根據(jù)熒光染色的情況可知，蛹蟲草的子囊孢子為單核菌絲。

圖1 蛹蟲草單子囊孢子的分離Fig. 1 Isolation of ascospores from the friuting body of Cordyceps militaris

CM17 的分生孢子懸濁液的顯微鏡觀察結果見圖2（a）。 圖中顯示分生孢子均無蛹蟲草菌絲雜質(zhì)，可以進行單孢分離。 分生孢子適當稀釋后接種到PDA 平板進行觀察（見圖 2（b）），然后從 PDA 平板中挑取孢子菌絲接種至斜面，見圖2（c）。 結果顯示分生孢子菌株間性狀均勻，沒有差異，說明分生孢子保留了親本的特性。 由Lou 等的研究可知，蛹蟲草的分生孢子均為單核[19]，因此分生孢子菌株也均為單核。

圖2 蛹蟲草分生孢子的分離Fig. 2 Isolation of conidia from the hypha of Cordyceps militaris

2.2 蛹蟲草的單孢菌株基因鑒定和對峙培養(yǎng)

運用基因的快速提取與鑒定的方法，對兩種蛹蟲草的孢子菌株進行基因鑒定與分類。 根據(jù)MAT基因型， 選取兩種類別的蛹蟲草孢子進行雜交育種， 一類為帶有MAT-α 交配型的ZGCM 子囊孢子菌株（共42 株，分別命名為ZGCMA1~A42），另一類為帶有MATHMG 交配型的CM17 分生孢子菌株（共 5 株，分別命名為 CM17C1~C5）。 MAT 基因的條帶單一（見圖 3（a））。 分生孢子無基因重組過程，因此， 只需挑選一株分生孢子CM17C4 和其他42 株蛹蟲草的子囊孢子（ZGCMA1~A42）進行對峙培養(yǎng)。誘導對峙線處長出子實體（見圖3（b））后，將對峙線的子實體接種于PDA 平板上。

圖3 蛹蟲草單孢菌株基因鑒定和對峙培養(yǎng)Fig. 3 Gene identification and dural culture of the spore strains from Cordyceps militaris

2.3 假定雜交種的鑒定

為鑒定出雜交種，運用基因的快速提取和雙重PCR 進行鑒定， 得到 10 株雜交菌株 （ZGCMA17-C4、ZGCMA27-C4、ZGCMA10-C4、ZGCMA16-C4、ZGCMA19-C4、ZGCMA42-C4、ZGCMA32-C4、ZGCMA1-C4、ZGCMA13-C4、ZGCMA11-C4）均含有MAT-α 和 MATHMG 兩種基因（見圖 4（a））。 因此，該10 株菌株為雜交成功的菌株。 同時對雜交菌株進行熒光染色并將其與孢子菌株的熒光染色結果進行對比，發(fā)現(xiàn)雜交菌株經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)雙核狀態(tài)（見圖4（b）），說明蛹蟲草菌株經(jīng)對峙培養(yǎng)后誘導形成子實體時，兩種孢子菌株相互纏繞進行基因交流，進一步形成了雙核菌株。

圖4 蛹蟲草假定雜交菌株的鑒定Fig. 4 Identification of the hybrids of Cordyceps militaris

2.4 雜交種和親本的生物學特性

如表1 所示，將蛹蟲草雜交菌株子實體烘干稱重 對 比 。 其 中 ZA10-C4、ZA13-C4、ZA19-C4 和ZA42-C4 的子實體產(chǎn)量與子實體中蟲草素產(chǎn)量均高于親本ZGCM。 其中ZA42-C4 的子實體產(chǎn)量（每瓶（3.24±0.08） g）最高為親本 ZGCM 子實體產(chǎn)量（每瓶 （1.83±0.00） g） 的 1.77 倍。 利用標準曲線 y=6×107x+350 636（R2=0.999 6）測得雜交種和親本的子實體和培養(yǎng)基中蟲草素質(zhì)量分數(shù)。 子實體的蟲草素產(chǎn)量中，雜交種子實體蟲草素質(zhì)量分數(shù)大多高于親本。 其中，ZA10-C4 子實體中蟲草素產(chǎn)量 （每瓶（12.82±0.85） mg/g） 最高為親本 ZGCM 子實體中蟲草素產(chǎn)量（每瓶（2.96±0.18） mg/g）的 4.33 倍。 對培養(yǎng)基中蟲草素質(zhì)量分數(shù)進行分析，雜交種蟲草素質(zhì)量分數(shù)均低于親本。 同時，通過對子實體的生長情況進行觀察（見圖 5），ZA10-C4、ZA13-C4、ZA19-C4和ZA42-C4 的子實體生長密度比親本ZGCM 高。但 ZA13-C4、ZA19-C4 和 ZA42-C4 的子實體生長一致性較差， 存在子實體高低不一致的情況。 而ZA10-C4 的子實體長勢較一致，子實體均為細長狀態(tài)，生長密度較高。經(jīng)過對比，蛹蟲草ZA10-C4 的子實體質(zhì)量相對較高（見圖6）。

圖6 蛹蟲草ZA10-C4 的子實體生長情況Fig.6 Growth of fruiting body from the hybrid ZA10-C4

表1 雜交種與親本的生物學特性Table 1 Biological characteristics of the hybrids and their parents

圖5 蛹蟲草親本與雜交種栽培情況Fig. 5 Cultivation of the parents and hybrids of Cordyceps militaris

3 結 語

蛹蟲草作為一種新資源食品，高品質(zhì)且富含蟲草素的蛹蟲草子實體更受市場青睞。 作者建立了一種高效快速的蛹蟲草雜交育種方案，選育出子實體生長狀況良好且蟲草素產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)蛹蟲草菌株。

雖然運用交配型基因作為分子標記指導蛹蟲草進行雜交配對，能夠提高到蛹蟲草親和性雜交的成功率[9]。 但是，在已有的研究中，基因的分子標記需要用CTAB 等傳統(tǒng)方法進行基因提取和鑒定較為麻煩。作者結合Zou 等的方法進行改良[20]，使蛹蟲草的基因能夠被快速提取和鑒定。 MATα 和MATHMG 具有高度保守性，根據(jù)其特點，在鑒定時嘗試采用雙重PCR 進行鑒定， 從而減少鑒定時間，提高鑒定的效率。 所鑒定的基因條帶單一，且條帶大小與MAT 基因條帶大小對應一致。 該方法也被用于鑒定雜交種基因。 結果表明，該方法可運用于蛹蟲草的高效篩選與鑒定，鑒定效果準確。

同時， 為探索蛹蟲草單孢雜交時菌核的變化，對蛹蟲草子囊孢子菌株的菌絲及雜交種菌株的菌絲進行熒光染色，對其菌核進行鑒定。 能初步得出蛹蟲草單孢菌株在進行雜交時，不同交配型蛹蟲草單孢菌株的菌絲間會相互纏繞，形成雙核菌絲的觀點。

實驗結果表明，蛹蟲草雜交菌株ZA10-C4 的子實體蟲草素產(chǎn)量與子實體品質(zhì)均優(yōu)于親本。 且由于親本CM17 菌株退化，無法生長子實體，該方法能夠使其恢復子實體高產(chǎn)蟲草素的性狀，提供了改善蛹蟲草易退化的新思路。 綜上所述，所設計的育種技術體系能夠高效快速選育出所需菌株，且成功選育出優(yōu)質(zhì)蛹蟲草新品種。