尚彬玲， 申 瑾， 陳 翔， 陳 樂， 章 中

（寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川750021）

細(xì)菌芽孢是在極端惡劣環(huán)境下產(chǎn)生的休眠體，其特殊的多層結(jié)構(gòu)使其自身具有高度抗逆性[1]，甚至在高溫條件下依然能夠存活。 枯草桿菌（Bacillus subtilis）芽孢作為食品中常見的污染菌，不僅耐熱而且耐壓[2]，這使得其難以被常規(guī)的食品殺菌工藝殺滅[3]，進(jìn)而容易導(dǎo)致食品產(chǎn)生腐敗現(xiàn)象，甚至引起食源性疾病[4-5]。 因此，亟待尋求一種能夠有效將其殺滅的技術(shù)，為食品加工技術(shù)的發(fā)展提供指導(dǎo)。

HPTS 作為一項很有前景的高壓加工技術(shù)，不僅能對食品中的細(xì)菌芽孢起到很好的殺滅效果，而且能夠更好地保持食品的色香味以及營養(yǎng)成分[6-7]，被認(rèn)為是殺滅細(xì)菌芽孢的一種有效方法。 而抗菌化合物能夠提高高壓處理對芽孢的滅活效果，天然的抗菌物質(zhì)受到人們的關(guān)注。 Nisin 作為一種含34 個氨基酸殘基的天然防腐劑[8]，通過與脂質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞膜表面形成通透孔道的方式實現(xiàn)滅菌目的[9]，對人體無害并且能夠被人體消化吸收，已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的實際生產(chǎn)[10-11]。 曾慶梅等對枯草桿菌芽孢進(jìn)行HPTS 處理后， 采用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)， 發(fā)現(xiàn)經(jīng)過處理后產(chǎn)生了芽孢外殼被破壞，內(nèi)含物質(zhì)完全泄漏，芽孢大量被殺滅的現(xiàn)象[12]。章中等研究表明，HPTS 會對芽孢內(nèi)膜水分子的通透屏障產(chǎn)生損傷[13-14]。

綜觀學(xué)者對殺菌技術(shù)的研究成果，主要是關(guān)注超高壓結(jié)合Nisin 對枯草桿菌芽孢的殺菌效果[15]，但有關(guān)HPTS 結(jié)合Nisin 殺菌效果及機(jī)理的研究鮮有報道。作者以枯草桿菌芽孢為對象，研究HPTS 結(jié)合Nisin 對其滅活效果、內(nèi)膜通透性和核酸蛋白質(zhì)的影響，探討HPTS 結(jié)合Nisin 的殺菌效果和機(jī)理，以期為HPTS 與Nisin 的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草桿菌（Bacillus subtilis）：來自中國普通微生物菌種保藏管理中心 （CGMCC）， 編號 As 1.433；Nisin （分析純）： 天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；碘化丙啶（PI）：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9000S 型雙光束紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀： 美國 PerkinElmer 公司產(chǎn)品；CyFlow Cube 8 流式細(xì)胞儀：日本SYSMEX（希森美康）株式會社產(chǎn)品；5L HPP 超高壓設(shè)備：包頭科發(fā)高壓科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢懸浮液的制備 芽孢的制備參照文獻(xiàn)[16]的方法，將菌種接入錳鹽培養(yǎng)基，37 ℃下劃線培養(yǎng)7 d，重復(fù)3 次。 將收集到的芽孢離心洗滌（9 000 r/min 條件下 15 min）3 次。 洗滌后的芽孢重懸在無菌水中，調(diào)整后的菌懸液濃度約為1.5×109CFU/mL，4 ℃保存，使用前在 80 ℃下水浴 15 min。

1.3.2 枯草桿菌芽孢懸浮液的HPTS 處理 取10 mL 芽孢懸浮液于無菌的聚乙烯真空包裝袋中，菌懸液中 Nisin 調(diào)整為 100、500 mg/L， 真空包裝后置于超高壓加壓釜中， 壓力為 200、550 MPa， 溫度為25、65、75 ℃，處理 20 min 后卸壓，樣品計數(shù)前在 4℃下保存6 h。

1.3.3 枯草桿菌芽孢平板計數(shù)方法 對處理前后的芽孢懸浮液進(jìn)行梯度稀釋， 平板中加入1 mL 稀釋菌液和培養(yǎng)基混勻后在37 ℃下倒置培養(yǎng)，24~48 h 后進(jìn)行計數(shù)。

式中：r 為芽孢處理前后降低的對數(shù)值；N0為HPTS處理前初始枯草桿菌芽孢活菌數(shù)，CFU/mL；Nt為HPTS 處理后枯草桿菌芽孢殘存活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 枯草桿菌芽孢內(nèi)容物泄漏量的測定 將處理前后的芽孢懸浮液在4 ℃下以9 000 r/min 離心15 min，以上清液為測定組，未處理的菌懸液為對照組，無菌水為空白對照，在260 nm 和280 nm 下測定吸光度。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測枯草桿菌芽孢內(nèi)膜通透性 將處理前后的芽孢懸浮液濃度稀釋到1×106~1×107CFU/mL。 加入PI 染色劑后用流式細(xì)胞儀檢測前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）、熒光通道 FL2 和FL3[17]。 采用 488 nm 激發(fā)光，PI 標(biāo)記細(xì)胞在 615 nm處發(fā)紅色熒光（FL3）。

1.3.6 ATR-FTIR 檢測 將處理前后的枯草桿菌芽孢懸浮液進(jìn)行真空冷凍干燥，將干燥好的樣品進(jìn)行檢測，分辨率為4 cm-1，波長掃描范圍為400~4 000 cm-1，掃描64 次。 得到的光譜數(shù)據(jù)用Origin 軟件進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

所有實驗至少重復(fù)3 次， 數(shù)據(jù)通過SPSS 26 進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 2018 軟件繪圖，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示， 圖表中不同字母表示其相關(guān)數(shù)據(jù)差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPTS 結(jié)合Nisin 處理對枯草桿菌芽孢的殺滅效果

圖1 表示HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 對枯草桿菌芽孢的殺滅效果。 可以看出，Nisin 為100 mg/L時， 在 200 MPa 結(jié)合 25、65、75 ℃條件下 r 分別為0.40、2.65、4.70，550 MPa 結(jié)合 25、65、75 ℃條件下 r分 別 為 0.53、2.70、5.77；Nisin 為 500 mg/L 時 ，200 MPa 結(jié)合 25、65、75℃條件下 r 分別為 0.45、3.15、5.04，550 MPa 結(jié)合 25、65、75 ℃條件下 r 分別為0.56、3.20、6.30。 這說明 HPTS 結(jié)合 Nisin 后的殺菌效果顯著高于HPTS 單獨處理（P<0.05）的效果，同時發(fā)現(xiàn)Nisin 質(zhì)量濃度越高， 其對芽孢的殺滅作用越強(qiáng)。 前期實驗結(jié)果表明[18]，單獨采用80 ℃或Nisin無法殺滅芽孢， 而80 ℃結(jié)合500 mg/L 的Nisin 后，芽孢的存活率下降了約1.4 lg （CFU/mL）。 這是因為HPTS 能夠?qū)ρ挎邇?nèi)膜產(chǎn)生一定影響[13-14]，并且Nisin也能夠作用于芽孢內(nèi)膜，使得HPTS 結(jié)合Nisin 對芽孢內(nèi)膜產(chǎn)生協(xié)同作用， 增加了芽孢內(nèi)膜的通透性，使水分子進(jìn)入導(dǎo)致其耐熱性下降，繼而產(chǎn)生了更好的殺菌效果。

圖1 HPTS 結(jié)合Nisin 處理枯草桿菌芽孢的滅活效果Fig. 1 Inactivation of Bacillus subtilis spores treated with Nisin combined with HPTS

2.2 HPTS 結(jié)合Nisin 處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量的影響

由于細(xì)胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)（主要為核酸和蛋白質(zhì)）泄漏量的變化可以反映芽孢內(nèi)膜的受損程度[19]，HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量的影響見圖2。HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 處理后， 芽孢的核酸和蛋白質(zhì)泄漏量均顯著增加（P<0.05）；在相同溫度和壓力處理條件下，Nisin 為500 mg/L 時芽孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的泄漏量都顯著高于100 mg/L， 說明提高Nisin 的質(zhì)量濃度能夠使芽孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的泄漏量增加。 這是因為芽孢內(nèi)膜受到了更大程度的破壞，膜通透性也隨之增大。 另外， 同質(zhì)量濃度的Nisin 處理條件下，隨著溫度升高，芽孢的紫外吸收物質(zhì)泄漏量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。 因此，HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 會增大芽孢內(nèi)膜的受損程度，使芽孢內(nèi)更多的核酸和蛋白質(zhì)流出。

圖2 HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量的影響Fig. 2 Effect of HPTS combined with Nisin at different mass concentrations on the leakage of UV absorbing substances from Bacillus subtilis spores

2.3 HPTS 結(jié)合Nisin 處理對枯草桿菌芽孢細(xì)胞膜損傷的影響

大分子熒光染料PI 能夠在芽孢細(xì)胞膜通透性增大到一定程度時透過細(xì)胞膜并嵌入雙鏈DNA，產(chǎn)生紅色的熒光，故芽孢內(nèi)膜通透性的變化可以通過流式細(xì)胞儀來反映[20]。 圖3 為樣品經(jīng)PI 染色后的直方圖，直方圖分為M1 和M2 兩個區(qū)域，其中M1 區(qū)域為陰性區(qū)域。 可以直觀地看出，HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 處理后，熒光分布都明顯向M2 區(qū)域移動，說明芽孢受到一定程度的損傷，芽孢內(nèi)膜通透性增加， 其與紫外吸收物質(zhì)泄漏量的研究結(jié)果一致。同時，與單獨HPTS 處理相比，HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 處理后移向M2 區(qū)域的比例增加，表明HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度的Nisin 比相同條件下單獨HPTS 處理對芽孢內(nèi)膜的破壞作用更強(qiáng)， 使芽孢內(nèi)膜的通透性增加。

2.4 紅外光譜分析

近年來，傅里葉變換紅外光譜技術(shù)應(yīng)用范圍很廣，由于其能夠綜合檢測細(xì)菌生理狀態(tài)，被作為細(xì)菌經(jīng)過處理后檢測細(xì)菌物質(zhì)變化的一項技術(shù)[21]。 這種檢測方法能夠?qū)Σ煌募t外吸收峰進(jìn)行分析，進(jìn)而得到細(xì)菌在經(jīng)過一些處理后其物質(zhì)的變化情況[22]。 從圖 4 可以直觀地看出，Nisin 與 HPTS 結(jié)合處理后，枯草桿菌芽孢紅外光譜的峰形、峰高等基本相似，從這種微小的改變很難分辨出特征峰位的變化情況。

圖4 HPTS 結(jié)合Nisin 處理前后枯草桿菌芽孢的紅外光譜圖Fig. 4 Infrared of Bacillus subtilis spores before and after the treatment of HPTS combined with Nisin

為了更加清楚地分辨處理前后枯草桿菌芽孢紅外光譜圖中特征峰的變化，有必要對原譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可以通過二階導(dǎo)數(shù)的方法對原譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（見圖5）[22]，這種方法可以將原譜圖中難以清晰觀察到的細(xì)小變化分辨開來，從而根據(jù)官能團(tuán)的位移及峰的形狀具體分析不同處理條件對細(xì)菌芽孢滅活作用的影響。 從圖5 可知，3 000~2 800 cm-1和1 700~900 cm-1波段的范圍有顯著峰位變化，其中包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖區(qū)域，這說明細(xì)菌芽孢的滅活與芽孢內(nèi)膜脂質(zhì)、核酸和肽聚糖的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖5 HPTS 結(jié)合Nisin 處理前后枯草桿菌芽孢的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig. 5 Secondary-derivative of Bacillus subtilis spores before and after the treatment of HPTS combined with Nisin

2.5 二階導(dǎo)圖譜分析

圖6 為HPTS 與Nisin 處理前后枯草桿菌芽孢在3 000~2 800 cm-1的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖。 可以看出，不同處理條件下紅外光譜有一些共同的特征峰變化（3 000~2 800 cm-1區(qū)域主要代表膜脂質(zhì)，2 855 cm-1和 2 925 cm-1處分別能夠反映—CH3和—CH2對稱和反對稱伸縮振動的變化情況[23]，—CH2的位移可以反映膜脂質(zhì)性質(zhì)[24]），前人研究顯示，如果脂肪?；湵弧叭诨倍_(dá)到高度構(gòu)象紊亂，則峰移至更高的波數(shù)[22]。因此，該結(jié)果表明HPTS與Nisin 結(jié)合處理后引起了細(xì)胞膜脂肪?；湹淖兓?； 同時，HPTS 與 Nisin 共同處理后，2 852 cm-1波段的峰位向高波數(shù)段移動， 并且與未處理組相比，2 929 cm-1波段的峰位移向低波數(shù)段， 表明不同質(zhì)量濃度Nisin 結(jié)合HPTS 處理能夠使枯草桿菌芽孢的細(xì)胞膜磷脂分子的疏水尾鏈混亂度增大。

圖6 HPTS 結(jié)合Nisin 處理前后枯草桿菌芽孢在3 000~2 800 cm-1 的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig. 6 Secondary-derivative FT-IR spectra of Bacillus subtilis spore nucleic acid treated by HPTS combined with Nisin at 3 000~2 800 cm-1

HPTS 結(jié)合 Nisin 處理前后枯草桿菌芽孢1 300~900 cm-1處的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖見圖7。其中波段1 300~900 cm-1主要代表細(xì)胞核酸， 能夠表征細(xì)胞壁成分的振動特征，1 232 cm-1和 1 082 cm-1吸收峰對應(yīng)的官能團(tuán)分別是核酸磷酸二酯主鏈的反對稱伸縮和對稱伸縮振動，與核酸變性相關(guān)[21-22]?？梢钥闯?，1 232 cm-1與 1 080 cm-1處的吸收峰發(fā)生了明顯變化，這是因為HPTS 結(jié)合Nisin 能夠?qū)е录?xì)菌芽孢內(nèi)核酸物質(zhì)的變性。 1 080 cm-1和1 232 cm-1特征峰都向低波數(shù)段移動，說明細(xì)胞內(nèi)核酸分子中的PO42-基團(tuán)氫鍵化程度發(fā)生了改變[25]，使氫鍵減弱，峰位向低波數(shù)段移動。

研究表明， 肽聚糖是芽孢細(xì)胞壁的主要成分，也是使芽孢具有耐壓性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，1 200~900 cm-1區(qū)域內(nèi)的吸收峰主要是C—O—C 伸縮振動引起的，可以從吸收峰的變化觀察肽聚糖層在處理前后的變化[25]。 從圖 7 可見，在 HPTS 結(jié)合 Nisin 處理前后芽孢的肽聚糖層發(fā)生了明顯的變化，肽聚糖層結(jié)構(gòu)的改變可能引起了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)而導(dǎo)致菌體死亡。

圖7 HPTS 結(jié)合Nisin 處理前后枯草桿菌芽孢1 300~900 cm-1 處的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig. 7 Secondary-derivative FT-IR spectra of Bacillus subtilis spore nucleic acid treated by HPTS combined with Nisin at 1 300~900 cm-1

3 結(jié) 語

通過對細(xì)菌芽孢內(nèi)膜損傷程度、 內(nèi)膜通透性、芽孢成分等指標(biāo)進(jìn)行檢測，探討了HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量濃度Nisin 對細(xì)菌芽孢的滅活效果及機(jī)理， 發(fā)現(xiàn)HPTS 與Nisin 有協(xié)同殺菌的作用， 殺菌效果優(yōu)于單獨的HPTS 處理。 綜合采用紫外吸收法、流式細(xì)胞術(shù)及紅外光譜方法對HPTS 結(jié)合Nisin 后的共同作用機(jī)理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Nisin 加入后，枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)的泄露量顯著增大，對芽孢內(nèi)膜的損傷程度更大，內(nèi)膜通透性增加，兩者共同作用后能夠?qū)е潞怂嵛镔|(zhì)發(fā)生變性，進(jìn)而影響芽孢的生理代謝，最終導(dǎo)致枯草桿菌芽孢的死亡。