錢 燦 ，侯卓妮 ，李宏法 ，梁宗鎖 *，童建全

（1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018；3.淳安漢廣中藥材初加工有限公司，浙江 杭州 311703；4.淳安縣農(nóng)業(yè)局中藥材管理站，浙江 杭州 311799）

近年來，隨著藥用植物消費(fèi)量的增加，許多野生資源現(xiàn)已瀕臨滅絕。藥用植物作為大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，其質(zhì)量的優(yōu)劣和安全直接影響著下游系列產(chǎn)品的質(zhì)量，只有保證藥材的品質(zhì)，才能確保藥品的療效[1-3]。

覆盆子藥材是薔薇科植物華東覆盆子（Rubus chingii Hu）的干燥果實(shí)，為藥食同源，使用歷史悠久。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，覆盆子具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、降血糖血脂、抗衰老、抗血栓、抗阿爾茨海默病、改善腎臟等作用。在臨床上常用于遺尿尿頻、遺精滑精和陽痿早泄等疾病的治療[4-8]。覆盆子中的主要化學(xué)成分有二萜（苷）、三萜（苷）、黃酮（苷）、甾體、香豆素類、酚酸類等。其中鞣花酸是《中華人民共和國藥典》（2020版，一部）中藥覆盆子中判別質(zhì)量的成分之一，鞣花酸具有抗腫瘤[9-14]、抗氧化、抗過敏、消炎抑菌、調(diào)節(jié)雌激素分泌和抗纖維化等多種生物學(xué)活性[15-19]，其含量是衡量覆盆子藥材質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

目前，關(guān)于覆盆子的研究主要集中在資源調(diào)查、種源分化、成分分離、質(zhì)量控制及藥理作用[20-28]方面，對覆盆子果實(shí)分級分類以及生長環(huán)境對覆盆子鞣花酸含量的影響仍不清楚。本研究通過對不同生長海拔高度、采收時(shí)間下獲得的相同種源的覆盆子樣品進(jìn)行分級分類和鞣花酸含量差異分析，為尋找影響覆盆子中鞣花酸含量積累的因素提供有力依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜儀；Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Sartorius BT25S 電子天平；電熱恒溫水浴鍋；LG-01高速中藥粉碎機(jī)。

1.2 試劑

鞣花酸對照品購自上海源葉生物科技有限公司（批號為 S24D11G135548，純度≥98%），甲醇、乙腈、甲酸（分析純）。

1.3 藥材

覆盆子果實(shí)藥材樣品均為2021年在浙江漢廣集團(tuán)覆盆子種植基地采摘，經(jīng)浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院梁宗鎖教授鑒定為薔薇科植物掌葉覆盆子的干燥果實(shí)，具體見表1、表2。

表1 覆盆子藥材樣品

表2 覆盆子藥材批號

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備

取鞣花酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含5 μg的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取覆盆子粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量。水浴鍋60℃加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1mL，置5 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 鞣花酸色譜條件

柱溫 35℃；流速 0.4 mL/min；進(jìn)樣量 5.0 μL；檢測波長254 nm；流動(dòng)相為0.1%A甲酸溶液-B乙腈溶液（0～2 min，94%→94%A；2～3 min，94%→84%A；3～8 min，84%→80%A；8～10 min，80%→94%A）。

理論板數(shù)按鞣花酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。色譜圖如圖1、圖2所示。

圖1 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 覆盆子樣品色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用鞣花酸對照品配制成 5.0 μg/mL、7.0 μg/mL、10.0 μg/mL、12.0 μg/mL 和 14.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用超高效液相色譜法測定，進(jìn)樣量5 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，鞣花酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制鞣花酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，得到回歸方程為y=101 402x-102 299，R2=0.999 2。

2.4 樣品分析

精密稱取覆盆子樣品粉末，測定并計(jì)算覆盆子中鞣花酸含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 覆盆子分級

據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020版）記載，覆盆子為聚合果，由多數(shù)小核果聚合而成，呈圓錐形或扁圓錐形。表面黃綠色或淡棕色，頂端鈍圓，基部中心凹入。宿萼棕褐色，下有果梗痕。小果易剝落，每個(gè)小果呈半月形，背面密被灰白色茸毛，兩側(cè)有明顯的網(wǎng)紋，腹部有突起的棱線。因此，將覆盆子果實(shí)分為果核、果肉、被茸毛3個(gè)部位。

市售覆盆子果實(shí)直徑0.8 cm以上為精品。因此，將覆盆子果實(shí)分為覆盆子果實(shí)直徑0.5～0.8 cm的0.5果和覆盆子果實(shí)直徑0.8 cm以上的0.8果。

3.1.1 覆盆子果實(shí)不同部位對覆盆子鞣花酸含量的影響

鞣花酸在覆盆子中的含量見表3：被茸毛＞果肉＞果核。被茸毛中鞣花酸含量遠(yuǎn)大于果肉和果核，果肉和果核中鞣花酸含量差別不大。因此，在種植、采收時(shí)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注被茸毛的保護(hù)。

表3 覆盆子果實(shí)不同部位中鞣花酸含量

3.1.2 覆盆子果實(shí)大小對覆盆子鞣花酸含量的影響

以浙江省夏同線基地為例，如圖3所示。鞣花酸的積累在不同大小的覆盆子果實(shí)中是有一定區(qū)別的，鞣花酸在果實(shí)直徑0.5～0.8 cm（0.5）中的含量＞在果實(shí)直徑0.8cm以上（0.8）中的含量。果實(shí)變大過程中糖分的積累增加，從而使酸性物質(zhì)減少。因此，采收時(shí)應(yīng)挑選直徑0.5～0.8 cm的果實(shí)，并不是果實(shí)越大越為精品。

圖3 覆盆子不同果實(shí)直徑的鞣花酸含量

3.2 覆盆子采收時(shí)間對覆盆子鞣花酸含量的影響

以浙江省龍嶺塘基地0.5果為例，如圖4所示。鞣花酸的積累在采收時(shí)間早晚期是有一定區(qū)別的。覆盆子藥材應(yīng)以灰綠色和黃綠色為主，紅棕色越少越好，紅棕色通常為近成熟果實(shí)，這種顏色果實(shí)也容易霉變或變質(zhì)。在4-5月采收期內(nèi)，采收期早期優(yōu)于晚期，4月末之后鞣花酸含量會逐漸降低。因此，建議應(yīng)在4月中旬覆盆子果實(shí)酸澀時(shí)盡早采摘。

圖4 覆盆子不同采收時(shí)間的鞣花酸含量

3.3 覆盆子生長海拔對覆盆子鞣花酸含量的影響

以浙江省基地各海拔高度為例，如圖5所示。鞣花酸的積累在海拔高與海拔低地區(qū)是有一定區(qū)別的，高海拔地區(qū)的覆盆子鞣花酸含量高。因此，覆盆子栽培時(shí)應(yīng)選擇海拔高的地區(qū)進(jìn)行種植。

圖5 覆盆子不同生長海拔高度的鞣花酸含量

4 討論與總結(jié)

覆盆子在浙江省內(nèi)多地均為主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，姚鑫等[29]確定了浙江省掌葉覆盆子青果具有較大的單株種質(zhì)選擇的潛力；毛菊華等[30]分析了華東覆盆子不同藥用部位果實(shí)、根、殘莖的化學(xué)成分含量；付彩群等[31]發(fā)現(xiàn)了浙江產(chǎn)覆盆子的鞣花酸含量顯著高于江西產(chǎn)，不同采收期的覆盆子青果的鞣花酸比黃果高，不同種植條件下向陽與背陽覆盆子中鞣花酸含量差異相對較小，但是對覆盆子被茸毛部位、果實(shí)大小、生長海拔、具體采收時(shí)間以及浙江具體種植地方面的研究尚少。故本研究對浙江省內(nèi)不同覆盆子果實(shí)部位、大小，不同生長海拔和具體采收時(shí)間下的覆盆子鞣花酸含量進(jìn)行UPLC測定，能夠快速準(zhǔn)確地進(jìn)行指標(biāo)成分測定。

研究發(fā)現(xiàn)覆盆子中鞣花酸含量在被茸毛上積累較多，并非集中在果肉果核上，且果實(shí)直徑為0.5～0.8 cm的覆盆子中鞣花酸含量高，并非市售認(rèn)定的果實(shí)越大越為精品。在浙江省不同的種植基地中，生長海拔高約為630 m、生長采收期在4月中旬采摘的覆盆子中鞣花酸含量高。因此，在覆盆子種植時(shí)應(yīng)選擇高生長海拔，采收時(shí)應(yīng)注重被茸毛的保護(hù)，果實(shí)直徑控制在0.5～0.8 cm，于4月中旬盡早采摘。

研究建立了鞣花酸含量和覆盆子果實(shí)部位、果實(shí)大小、生長海拔高度和生長采收時(shí)間之間的聯(lián)系，從而為建立系統(tǒng)性種植及采收方法并解決產(chǎn)業(yè)發(fā)展技術(shù)瓶頸奠定基礎(chǔ)。