趙紅 鄧雨晴 曾淑琴 曾熒 張彩霞 張慧博 張麗佳 張玲 張妮 尹明華

摘要：為了深入探究江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因的功能，通過(guò)江西鉛山紅芽芋試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因的核心片段，利用RT-PCR 技術(shù)克隆該基因，并采用生物信息學(xué)方法、轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)表達(dá)和實(shí)時(shí)定量 PCR進(jìn)行序列分析、亞細(xì)胞定位、器官表達(dá)分析和功能分析。結(jié)果表明：江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因cDNA總長(zhǎng)度為522 bp，G+C 含量為58.62%;由174個(gè)氨基酸組成，分子量19 073.87 u，等電點(diǎn)9.30，為親水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（31.61%）、β-片層（12.64%）、無(wú)規(guī)則卷曲（55.75%） 構(gòu)成，三級(jí)結(jié)構(gòu)為單體;主要存在細(xì)胞核中;在進(jìn)化上與Colocasia esculenta（芋）的親緣關(guān)系較近，與Colocasia esculenta（芋）hypothetical protein Taro_030839（MQL98131.1）在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。江西鉛山紅芽芋TIFY 9蛋白具有典型植物TIFY 9的結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列及核酸序列與同源物種同源性高達(dá)100%，在進(jìn)化上高度保守。煙草葉片亞細(xì)胞定位分析表明，TIFY 9定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，TIFY 9基因在江西鉛山紅芽芋中的表達(dá)存在器官特異性，在江西鉛山紅芽芋不同組織部位均有表達(dá)，且在葉中和球莖膨大初期表達(dá)量最高。在煙草花葉病毒脅迫下，與TIFY 9非轉(zhuǎn)基因煙草相比較，TIFY 9轉(zhuǎn)基因煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、實(shí)際光化學(xué)量子效率（ΦPS Ⅱ）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著增加，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）顯著下降，表明TIFY 9基因響應(yīng)病毒脅迫應(yīng)答可能是依賴光合作用的提高。

關(guān)鍵詞：江西鉛山紅芽芋;TIFY 9基因;基因克隆;功能分析;轉(zhuǎn)基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： S632.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0041-09

收稿日期：2021-04-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32060092、31960079）;2021年度江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：GJJ211729）;上饒市科技局平臺(tái)載體建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2020I001、2019I017）。

作者簡(jiǎn)介：趙 紅（1966—），女，江西上饒人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物生物技術(shù)研究工作。E-mail：928807480@qq.com。

通信作者：尹明華，碩士，教授，主要從事植物生物技術(shù)研究工作。E-mail：yinminghua04@163.com。

江西鉛山紅芽芋（Colocasia esculenta L. Schoot var. cormosus‘Hongyayu’）屬于天南星科本草植物，藥食兼優(yōu)，藥用可寬腸胃、補(bǔ)脾胃、腹中痞塊、消癆散結(jié)、調(diào)節(jié)免疫，食用營(yíng)養(yǎng)豐富、清淡爽口、粉糯細(xì)膩，是老幼皆宜的美味佳肴[1]。2013年4月，江西鉛山紅芽芋核準(zhǔn)為國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，現(xiàn)已成為江西省上饒市鉛山縣“兩紅”（紅芽芋和河紅茶）產(chǎn)業(yè)之一[2]。TIFY 蛋白屬于植物特有GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族，由于花序分生組織表達(dá)的鋅指蛋白（zinc-finger protein expressed in inflorescence meriste，ZIM）家族具有高度保守的 TIFY 功能結(jié)構(gòu)域，因此TIFY 蛋白也被命名為 TIFY 基因家族。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的組成，TIFY 家族蛋白可分為 4 個(gè)亞家族 （TIFY、JAZ、ZML 和 PPD）和2個(gè)亞群（亞群Ⅰ含 C2C2-GATA 結(jié)構(gòu)域，亞群Ⅱ不含該結(jié)構(gòu)域）[3]。TIFY 蛋白是控制植物中各種生物途徑的主要關(guān)鍵因子，在植物發(fā)育過(guò)程中參與防御和應(yīng)激反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫響應(yīng)[4-5]。TIFY1是首個(gè)在擬南芥中被鑒定的TIFY 家族轉(zhuǎn)錄因子[6]。目前，TIFY家族已被克隆和鑒定[7-9]。植物病毒有“植物癌癥”之稱(chēng)，可通過(guò)維管束侵染植物，造成生物脅迫逆境，經(jīng)濟(jì)損失巨大，因此培育無(wú)病毒植株至關(guān)重要[10]。因此，對(duì)江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因進(jìn)行克隆和功能分析對(duì)培育江西鉛山紅芽芋的脫毒品種具有重要意義。近年來(lái)，TIFY 蛋白在植物抗逆脅迫中的研究成為熱點(diǎn)，多集中在植物應(yīng)對(duì)一些非生物脅迫如干旱、鹽堿、滲透等逆境上，而對(duì)于生物脅迫相關(guān)研究較少。有研究表明，玉米的ZmJAZ基因?qū)δ承┥锩{迫真菌（如絲黑穗、莖腐病和炭疽?。┚哂幸欢ǔ潭鹊拿{迫響應(yīng)[11]。目前，對(duì)紅芽芋的研究主要集中在脫毒快繁[2]、微芋誘導(dǎo)[1]、下游加工[12]、成分分析[13]等方面，關(guān)于紅芽芋TIFY 9蛋白的克隆及其功能分析尚未見(jiàn)報(bào)道。利用RT-PCR 技術(shù)克隆江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因，并采用生物信息學(xué)方法、煙草轉(zhuǎn)基因技術(shù)和實(shí)時(shí)定量 PCR進(jìn)行序列、功能和組織表達(dá)分析，旨在為揭示江西鉛山紅芽芋TIFY 9的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為從分子水平選育江西鉛山紅芽芋脫毒品種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

江西鉛山紅芽芋試管苗。試驗(yàn)于2020年5月至2021年4月在上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成 用Trizol 試劑提取江西鉛山紅芽芋試管苗的總 RNA，提取步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照 M-MLV cDNA 第1鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成 cDNA 第1鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用 Oligo（dT） 18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 TIFY 9基因的克隆 利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN3508_c0_g1），運(yùn)用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物（F：GGGCGTGGTCCTCGGATAACA;R：AGACGGTGACGGTGCCGTTGT）。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 2 min;95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞 Escherichia coli DH5α，經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 TIFY 9基因的生物信息學(xué)分析 使用 BioEdit軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用 ProtParam預(yù)測(cè)酶的理化性質(zhì)，用 ProtScale預(yù)測(cè)酶的疏/親水性。使用GOR I軟件在線預(yù)測(cè)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MOLD在線預(yù)測(cè)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用 WoLFPsort在線預(yù)測(cè)基因的表達(dá)部位。通過(guò)軟件DNAMAN和 Bioedit進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.4 基因克隆和載體構(gòu)建 以提供的目的基因序列設(shè)計(jì)引物（去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA），CZ-T9-BamHⅠ-JF：ATGTCTAGACTCGAGATGTCCAAGTCTTACGTCG;CZ-T9-BamHⅠ-GFPR：GGCCGCTGTACACATGCAGGGAGGAGAGGGAAG，粗體部分為載體同源重組序列，以轉(zhuǎn)錄組篩選的cDNA為模板，以所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase）。PCR反應(yīng)體系（總體積50 μL）包括 17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix（均為10 mmol/L）、2 μL 模板DNA、2 μL引物1（10 μmol/L）、2 μL引物2（10 μmol/L）和 1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease（1 U/μL）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，39個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。將條帶切膠回收，即為目的基因片段。用BamHI酶切載體pCambia2301-KY-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應(yīng)（采用賽默飛世爾科技公司或TaKaRa公司相應(yīng)限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品）。酶切反應(yīng)體系包括2 μL 10×K Buffer、5 μL 載體質(zhì)粒、2 μL BamHⅠ和ddH2O（補(bǔ)足 40 μL）。酶切產(chǎn)物純化后與上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)（重組反應(yīng)試劑盒為南京諾唯贊生物科技股份有限公司的ClonExpress-Ⅱ One Step Cloning Kit）。重組連接反應(yīng)體系（總體積10 μL）包括4 μL 線性化載體、1 μL 插入片段、2 μL 5×CE Ⅱ Buffer、1 μL Exnase Ⅱ和ddH2O（補(bǔ)足10 μL）。上述反應(yīng)液使用移液器輕輕吸打混勻，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。置于37 ℃反應(yīng)30 min，隨后立即置于冰上冷卻。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。挑取PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序。擴(kuò)增和測(cè)序引物為插入目的基因兩側(cè)的載體序列（目的基因較短則只進(jìn)行一側(cè)測(cè)序），分別為35S-F：5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′;GFP-JR：5′-GGGTGAGCTTGCCGTAGGTG-3′。

1.2.5 煙草葉片亞細(xì)胞定位 播種煙草，培養(yǎng)約1個(gè)月用于試驗(yàn);將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，涂布卡那霉素抗性平板，挑取單克隆于YEB液體培養(yǎng)基在28 ℃搖床內(nèi)小搖、大搖培養(yǎng) 2 d，菌體4 000 r/min離心4 min，去上清后菌體用用10 mmol/L MgCl2（含120 μmol/L乙酰丁香酮）懸浮液重懸菌體，調(diào)整D600 nm值為0.6左右;用無(wú)針頭的1 mL注射器吸取農(nóng)桿菌液，從煙草葉片下表皮（背面）壓迫注射;將注射完成的煙草植株弱光培養(yǎng)2 d，即可觀察;接種2 d后取注射區(qū)域的煙草葉片，制作玻片，在激光共聚焦顯微鏡（FluoView FV1Oi，OLYMPUS公司）下觀察、拍照;同時(shí)以空載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌作為對(duì)照重復(fù)上述操作。葉綠體熒光信號(hào)說(shuō)明：葉綠體熒光信號(hào)激發(fā)波長(zhǎng)640 nm，發(fā)射波長(zhǎng)675 nm;綠色熒光蛋白（GFP）信號(hào)說(shuō)明：綠色熒光蛋白GFP激發(fā)光488 nm，發(fā)射光510 nm。

1.2.6 煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)和GUS組織化學(xué)染色 煙草葉片用農(nóng)桿菌侵染后均經(jīng)過(guò)4次篩選/繼代，誘導(dǎo)出抗性芽，再轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中。采用PCR對(duì)其再生苗進(jìn)行鑒定，得到TIFY 9基因的煙草轉(zhuǎn)基因株系。PCR檢測(cè)引物：載體上游引物35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC;目的基因下游引物：GCAGGGAGGAGAGGGAAG。使用南京諾唯贊公司Taq 酶擴(kuò)增體系和條件。2×Taq Master Mix 擴(kuò)增體系（共20 μL）包括7μL ddH2O、10 μL 2×Taq Master Mix、1 μL 模板DNA、1 μL引物1（10 μmol/L）、1 μL 引物2 （10 μmol/L）。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。GUS組織化學(xué)染色：采集煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的葉片組織，加GUS染液于37 ℃過(guò)夜染色;染色后的葉片再用75%的乙醇脫色（去除葉綠素），也于37 ℃過(guò)夜。倒掉脫色乙醇后再用75%乙醇清洗后觀察并拍照。

1.2.7 煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標(biāo)檢測(cè) 培養(yǎng)3個(gè)月后，取含煙草花葉病毒的煙草試管苗葉片放在研缽中并加入適量磷酸緩沖液研磨成糊狀病樣汁液;然后在煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗幼嫩的葉面上灑少許等量金剛砂，蘸取含煙草花葉病毒的煙草試管苗等量病樣汁液在灑了金剛砂的葉面上輕抹 3次（模擬蚜蟲(chóng)的病毒田間傳播），之后用無(wú)菌水清洗葉面;然后放入智能人工氣候室內(nèi)澆灌MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng);2個(gè)月后采用Li-6400便攜式光合測(cè)定儀（LI-COR公司，美國(guó)）儀測(cè)定煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)TIFY 9基因組織表達(dá)的差異顯著性（α=0.05）。

1.2.8 TIFY 9基因的組織表達(dá)分析 分別取江西鉛山紅芽芋試管苗的根、莖、葉、試管球莖（初期、中期和末期）RNA 500 ng，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量 PCR（qRT-PCR，SYBR Green Ⅰ）檢測(cè)內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。設(shè)計(jì)引物（F：TGCCCTGAGCGTTCCCTAC;R：ACCCGCCTCCACTTCTTCC;長(zhǎng)度：178 bp;Tm：583 ℃）。qRT-PCR 檢測(cè)采用20 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。使用 2-ΔΔCT 法計(jì)算基因表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)TIFY 9基因組織表達(dá)的差異顯著性（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA序列

通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)（圖1），江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因cDNA總長(zhǎng)度為522 bp（圖2），G+C含量為58.62%。

2.2 氨基酸序列

Protparam預(yù)測(cè)顯示江西鉛山紅芽芋TIFY 9氨基酸序列見(jiàn)圖3。該基因由174個(gè)氨基酸組成，分子量19 073.87 u，等電點(diǎn)9.30，為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)量和比例為Ala（A）（18，10.3%）、Arg（R）（13，7.5%）、Asn（N）（7，4.0%）、Asp（D）（8，4.6%）、Cys（C）（3，1.7%）、Gln（Q）（3，1.7%）、Glu（E）（9，5.2%）、Gly（G）（6，3.4%）、His（H）（1，06%）、Ile（I）（8，4.6%）、Leu（L）（13，7.5%）、Lys（K）（9，5.2%）、Met（M）（6，3.4%）、Phe（F）（7，40%）、Pro（P）（17，9.8%）、Ser（S）（21，12.1%）、Thr（T）（10，5.7%）、Trp（W）（2，1.1%）、Tyr（Y）（3，1.7%）、Val（V）（10，5.7%）。帶負(fù)電殘基總數(shù)（Asp+Glu）為17，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為22。估計(jì)半衰期為30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外）;>20 h（酵母，體內(nèi)）;>10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）。不穩(wěn)定指數(shù)：失穩(wěn)指數(shù)（Ⅱ）計(jì)算為5469，這將蛋白質(zhì)分類(lèi)為不穩(wěn)定的。

2.3 親疏水性分析

從圖4可知，高峰值（正值）的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而低谷值（負(fù)值）的區(qū)域是親水區(qū)域。其最大疏水值為1.5左右，說(shuō)明在該多肽中該處的疏水性最強(qiáng);親水峰最大值為-2.5左右，整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的親水性，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

GOR 預(yù)測(cè)顯示江西鉛山紅芽芋TIFY 9二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋（Hh，31.61%）、β-片層（Ee，12.64%）、 無(wú)規(guī)則卷曲（Cc，55.75%）構(gòu)成（圖5）。從分布位點(diǎn)上來(lái)看，C端和N端主要含α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和β-片層，且無(wú)規(guī)則卷曲、β-片層和 α-螺旋則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.5 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SWISS-MODEL預(yù)測(cè)顯示江西鉛山紅芽芋TIFY 9的三級(jí)結(jié)構(gòu)為同源三聚體（圖6）。

2.6 亞細(xì)胞定位

采用 WoLFPsort在線軟件對(duì)江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖7顯示，定位于細(xì)胞核中的數(shù)量為12，線粒體中的數(shù)量為1，葉綠體中的數(shù)量為1。表明江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因主要存在細(xì)胞核中。

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)（圖8）可見(jiàn)，江西鉛山紅芽芋與Colocasiaesculenta（芋）在一個(gè)大分支下，這說(shuō)明江西鉛山紅芽芋TIFY 9在進(jìn)化上與Colocasia esculenta（芋）的親緣關(guān)系較近，與Colocasia esculenta hypothetical peotein Taro_030839（MQL98131.1）在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

2.8 同源蛋白的序列比對(duì)信息

同源蛋白的序列比對(duì)信息見(jiàn)圖9，其中※號(hào)區(qū)域是該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。

2.9 目的片段擴(kuò)增與瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建

以提供的目的基因序列設(shè)計(jì)引物（去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，在目標(biāo)位置擴(kuò)增到單一條帶，大小正確。將條帶切膠回收，即為目的基因片段（圖10）。用BamHⅠ酶切載體pRI101-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應(yīng)。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。挑取PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)（圖11），同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序。測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，目的基因已插入載體，表達(dá)載體構(gòu)建準(zhǔn)確（圖12）。

2.10 亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)，將TIFY 9融合綠色熒光蛋白（GFP）的載體質(zhì)粒TIFY 9-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，吸取農(nóng)桿菌液，壓迫注入煙草葉片下表皮（背面）進(jìn)行煙草病毒增殖蛋白1亞細(xì)胞定位分析（圖13）。利用激光共聚焦顯微鏡觀察，融合GFP的TIFY 9轉(zhuǎn)化煙草葉片只在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核膜觀察到綠色熒光，表明TIFY 9定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

2.10 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定、GUS組織化學(xué)染色和光合特征

煙草葉片用農(nóng)桿菌侵染后均經(jīng)過(guò)3次篩選/繼代，誘導(dǎo)出抗性芽，再轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，最后將其移栽成活（圖14）。經(jīng)PCR檢測(cè)（圖15），獲得TIFY 9轉(zhuǎn)基因煙草和TIFY 9非轉(zhuǎn)基因煙草。在PCR檢測(cè)基礎(chǔ)上，對(duì)2種煙草進(jìn)行GUS染色驗(yàn)證（圖16）。結(jié)果表明，PCR檢測(cè)和GUS檢測(cè)結(jié)果一致。然后模擬蚜蟲(chóng)的病毒田間傳播，在煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗涂抹含煙草花葉病毒的煙草試管苗等量病樣汁液，2個(gè)月后測(cè)定煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。結(jié)果表明，與TIFY 9非轉(zhuǎn)基因煙草相比較，TIFY 9轉(zhuǎn)基因煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、實(shí)際光化學(xué)量子效率（ΦPSⅡ）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著增加，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）顯著下降（表1）。

2.11 不同器官及球莖膨大不同時(shí)期TIFY 9基因的表達(dá)分析

以江西鉛山紅芽芋的GAPDH為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因在江西鉛山紅芽芋不同器官中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在不同組織器官的表達(dá)情況差異顯著（圖17），其中江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因在葉和球莖膨大初期中表達(dá)量最高。

3 結(jié)論與討論

TIFY蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-15]。前期研究中，筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)1個(gè)江西鉛山紅芽芋TIFY9基因在超低溫療法脫毒處理的脫毒苗葉片中的表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明它是一個(gè)芋花葉病毒（DsMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、芋羽狀斑駁病毒（TFMoV）等病毒侵染后誘導(dǎo)的基因[1]。在本試驗(yàn)中，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示江西鉛山紅芽芋TIFY 9主要定位在細(xì)胞核、線粒體和葉綠體中，與煙草葉片TIFY 9轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)過(guò)表達(dá)的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果一致，也與轉(zhuǎn)錄因子核定位特征一致[16]。有研究表明，龍血樹(shù)DcTIFY基因在根和莖中的表達(dá)量最高[17]，而在本試驗(yàn)中，江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因在葉和球莖膨大初期中表達(dá)量最高。江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因在葉中的表達(dá)水平顯著高于其他部位（根和莖），且在球莖膨大初期的表達(dá)水平

顯著高于其他時(shí)期（中期和晚期），說(shuō)明它可能在葉片中和球莖膨大初期發(fā)揮著重要的作用，推測(cè)江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因可能參與了調(diào)控球莖膨大成熟過(guò)程。在本試驗(yàn)中，江西鉛山紅芽芋TIFY9 轉(zhuǎn)錄因子與Colocasia esculenta（芋）hypothetical peotein Taro_030839（MQL98131.1）在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系（100%），說(shuō)明江西鉛山紅芽芋TIFY 9相對(duì)保守。有研究表明，TIFY基因在病原體反應(yīng)中起著重要作用[8，18]。在本試驗(yàn)中，江西鉛山紅芽芋TIFY 9蛋白編碼174個(gè)氨基酸，為親水性不穩(wěn)定蛋白，因此分析判斷江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因可能與病毒脅迫逆境相關(guān)。經(jīng)禾甲安處理后的番木瓜感病植株中CpTIFY10A-like基因表達(dá)量顯著升高，而番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）基因表達(dá)量顯著降低，推測(cè)禾甲安可誘導(dǎo)CpTIFY10A-like基因高效表達(dá)，致使PRSV基因表達(dá)量大幅度降低[19]。本試驗(yàn)?zāi)M蚜蟲(chóng)的病毒田間傳播，在煙草TIFY 9轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽上苗涂抹含煙草花葉病毒的煙草試管苗等量病樣汁液，與TIFY 9非轉(zhuǎn)基因煙草相比較，TIFY 9轉(zhuǎn)基因煙草的光合參數(shù)（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、實(shí)際光化學(xué)量子效率（ΦPSⅡ）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著增加，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）顯著下降，說(shuō)明江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因響應(yīng)病毒脅迫應(yīng)答可能是依賴光合作用的提高。本研究通過(guò)克隆江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)信息、組織表達(dá)量、亞細(xì)胞定位和功能分析，為今后深入進(jìn)一步探索江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因的功能及表達(dá)蛋白互作提供理論參考，同時(shí)為研究江西鉛山紅芽芋TIFY 9基因在江西鉛山紅芽芋抗芋花葉病毒（DsMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、芋羽狀斑駁病毒（TFMoV）等病毒侵染過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)理打下基礎(chǔ)，對(duì)江西鉛山紅芽芋脫毒育種具有重要意義。

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