董朝霞,鐘錦,俞雯雯,洪鑫發(fā),陳勇*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣東 廣州 510642;3.廣東煙草韶關(guān)市有限公司乳源縣局分公司,廣東 韶關(guān)512700)

稗草(Echinochloacrusgalli)為世界十大惡性雜草之一[1]。目前在61個(gè)國家和地區(qū)均有發(fā)現(xiàn),其對(duì)水稻的危害極其嚴(yán)重。如今防治稗草主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防控以及生物和物理等防控措施。尖角突臍孢菌(Exserohilummonoceras)屬半知菌類(Deuteromycotina),是一種對(duì)稗草有較強(qiáng)致病性但對(duì)水稻(Oryzasativa)安全的一種生防潛力菌[2-5]。由于大田條件復(fù)雜多變,將尖角突臍孢菌直接使用到大田時(shí),其防效遠(yuǎn)低于室內(nèi)除稗防效[5-8]。因此,為了更好地利用尖角突臍孢菌,篩選出高致病力、產(chǎn)孢量高、抗紫外光線的優(yōu)勢(shì)菌株已經(jīng)成為亟待解決的問題。

當(dāng)前,主要通過物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變進(jìn)行微生物育種[9-12]。微生物誘變育種是一項(xiàng)通過基因突變技術(shù)對(duì)微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行改變的技術(shù)。通過改造,人們可以獲得具有特定的且能穩(wěn)定遺傳的菌株[11]。在物理誘變中,紫外光誘變工作量低、定向強(qiáng)、效率高,故使用頻率較高[13]。Lotfy等[14]用紫外光誘導(dǎo)黑曲霉中的檸檬酸過量產(chǎn)生,最終獲得穩(wěn)定正向突變體W5,檸檬酸產(chǎn)量為62.50%,與親本野生型菌株相比增加約3.2倍。王博等[15]用低溫和紫外誘變技術(shù)選育絮凝優(yōu)異的絮凝菌,通過紫外誘變和低溫脅迫處理得到一株對(duì)生活污水絮凝率達(dá)75.35%的誘變菌株FB-5,且該菌株遺傳性狀不變。本試驗(yàn)以尖角突臍孢菌X27為研究材料,采用紫外光照射該菌株分生孢子懸液獲得一系列紫外突變菌株,以 2葉 1心的稗草為生測(cè)對(duì)象,篩選獲得長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落形態(tài)穩(wěn)定、致病力強(qiáng)、抗紫外光的誘變株,主要從尖角突臍孢菌落生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、紫外耐受力以及對(duì)作物安全性等方面篩選誘變株,為高致病力尖角突臍胞菌的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

尖角突臍孢菌株X27采集于江西石城稗草葉上,分離純化后保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草實(shí)驗(yàn)室。稗草采集于廣東省廣州市增城區(qū)寧西街道華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地。從野外采集的稗草種子曬干后,保存于 4 ℃冰箱中。

菌株培養(yǎng)和檢測(cè)材料:吐溫-80、瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、無水乙醇、新型基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 尖角突臍孢菌株的紫外光誘變

取尖角突臍孢菌X27的分生孢子配成1×104mL-1的孢子懸浮液。取2～3 mL孢子懸浮液于無菌培養(yǎng)皿中,紫外光燈光分別照射(功率15 W,距離為15 cm)1、3、5、10、30和60 min,然后均取出100 μL孢子懸浮液在紅光下用涂布器接種于PDA培養(yǎng)基平板上,每個(gè)處理4次重復(fù),未經(jīng)紫外光照射的孢子懸浮液作對(duì)照。28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至少3 d,記錄最終菌落的數(shù)量并計(jì)算致死率。致死率=(對(duì)照菌落數(shù)-誘變平板菌落數(shù))/對(duì)照菌落數(shù)×100%。取尖角突臍孢菌X27的孢子懸浮液經(jīng)紫外光分別照射5、10、15、20、25和30 min,確定尖角突臍孢菌紫外光誘變的最佳時(shí)間。

1.3 高致病力尖角突臍孢菌誘變株的篩選

1.3.1 誘變株產(chǎn)孢量測(cè)定根據(jù)1.2節(jié)的最佳時(shí)間對(duì)尖角突臍孢菌進(jìn)行誘變選育,選育出300個(gè)菌株,分別編號(hào)并保存。在尖角突臍孢菌X27和誘變株菌絲生長(zhǎng)均勻處,取直徑為0.8 cm的菌絲塊,放入新的PDA培養(yǎng)基平板上。14 d后,用10 mL 0.05%吐溫-80水溶液把培養(yǎng)基上的孢子全部洗下,200 r·min-1振蕩20 min后,4層紗布過濾并保存?zhèn)溆谩Ｔ陲@微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子懸液產(chǎn)孢量,每個(gè)菌株重復(fù)4次。

1.3.2 稗草離體葉片法對(duì)誘變株致病力測(cè)定選取2葉1心期、同一葉位長(zhǎng)勢(shì)良好的葉片,去除稗草葉片的尖端和基部,保留葉中部5～6.5 cm。放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,加入適量的無菌蒸餾水,在葉片上針刺形成傷口,吸取5 μL孢子懸浮液點(diǎn)于傷口上。用菌株X27作為對(duì)照,置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中,光、暗培養(yǎng)時(shí)間各12 h,濕度70%～90%。3 d后測(cè)量病斑直徑,并計(jì)算菌株離體葉片致病力,每個(gè)處理均重復(fù)4次。

1.3.3 誘變株產(chǎn)孢量和致病力綜合聚類分析按照系統(tǒng)聚類法中最長(zhǎng)距離法,采用誘變株產(chǎn)孢量和致病力的相對(duì)值對(duì)誘變株進(jìn)行聚類分析。在聚類水平D2=10.0 時(shí)可以劃分為三大類群。

1.3.4 誘變株活體侵染致病力測(cè)定從300個(gè)誘變菌株里篩選產(chǎn)孢量和致病力較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株作為活體侵染的材料。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后,將優(yōu)勢(shì)菌株配制成1.0×106mL-1的孢子懸浮液,并噴于2葉 1心期的活體稗草上,用X27菌種作為對(duì)照,將處理過的活體植株于28 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h(培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié)),再移入溫室中生長(zhǎng)。1周后調(diào)查分級(jí)和發(fā)病情況,計(jì)算病情指數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)4次。

稗草病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí):全株無病,葉片上無斑點(diǎn);1級(jí):僅有小的針尖大小的褐點(diǎn);2級(jí):全株葉片上有較大褐點(diǎn),并有1～2 mm的典型或橢圓形壞死病斑均勻分布在葉片上,約占葉面積2%;3級(jí):全株有典型病斑,侵染面積小于10%;4級(jí):全株有典型病斑,侵染面積占10%～50%;5級(jí):全株有典型病斑,侵染面積占51%～75%;6級(jí):全株有典型病斑,全部葉片死亡。

式中:i表示病級(jí);n表示植株發(fā)病為i級(jí)的株數(shù);N表示調(diào)查總株數(shù);6表示植株發(fā)病最高級(jí)。

1.4 誘變菌株ITS-PCR擴(kuò)增

ITS序列的擴(kuò)增采用真菌分子鑒定的通用引物ITS1和ITS4[16]。ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)單一條帶PCR產(chǎn)物進(jìn)行ExoSAP-IT純化,對(duì)有非特異條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化。

1.5 尖角突臍孢菌誘變株的生物學(xué)特性研究

1.5.1 尖角突臍孢菌株的菌落生長(zhǎng)速率測(cè)定在尖角突臍孢菌X27菌株和高致病力誘變株X27-UV148、X27-UV048、X27-UV045、X27-UV286的PDA培養(yǎng)基上的分生孢子中,取菌絲生長(zhǎng)均勻處直徑為0.8 cm的菌絲塊接種到PDA培養(yǎng)基中間,置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d觀察并記錄菌落生長(zhǎng)直徑,共觀察11 d,每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.5.2 尖角突臍孢菌誘變株對(duì)紫外光耐受力測(cè)定將X-27菌株和高致病力誘變株X27-UV148、X27-UV048、X27-UV045、X27-UV286配制成1.0×104mL-1的懸浮液,200 r·min-1振蕩培養(yǎng)20 min,分散孢子,分成2組,一組經(jīng)紫外光照射25 min(紫外燈功率15 W,距離為15 cm),另一組不經(jīng)紫外光照射作為對(duì)照組,然后將100 μL孢子懸液滴在滅菌的載玻片上,再把含孢子懸液的載玻片放入鋪有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于12、24、36和48 h時(shí)觀察100個(gè)尖角突臍孢菌分生孢子萌發(fā)的情況。萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)以芽管長(zhǎng)度超過孢子短軸為標(biāo)準(zhǔn)。以上操作均在紅光下完成,每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.5.3 尖角突臍孢菌誘變株耐熱性測(cè)定將X-27菌株和高致病力誘變株X27-UV148、X27-UV048、X27-UV045、X27-UV286配制成1.0×104mL-1的懸浮液,然后取孢子懸浮液100 μL滴在滅菌的載玻片上,再把含孢子懸液的載玻片放入鋪有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中,分別于10、15、20、25、28、30、32、37和40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于8 h時(shí)觀察100個(gè)尖角突臍孢菌分生孢子萌發(fā)的情況。萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)以芽管長(zhǎng)度超過孢子短軸為標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.6 尖角突臍孢菌誘變株的安全性試驗(yàn)研究

選擇稗草發(fā)生地的主要作物,主要包括水稻、小麥、高粱、大豆、苦瓜、菜心、花生、玉米。2葉1心期的稗草幼苗為對(duì)照。水稻、小麥、高粱每盆各4株,大豆、苦瓜每盆各2株,菜心每盆10株,花生和玉米各 1株,稗草每盆6株。每種作物和稗草4次重復(fù)。

以上各種植物均留有4盆對(duì)照,且與其他植物分開擺放。對(duì)照植株噴0.05%無菌吐溫-80水溶液,處理株噴1.0×106mL-1孢子懸液(同1.3.4節(jié)),噴藥量均為100 mL·m-2。施藥后置于28 ℃、濕度為80%的人工氣候箱中保濕培養(yǎng)48 h,最后再移到室外正常生長(zhǎng)。2周后觀察、記錄測(cè)試結(jié)果。按處理后植株葉片病害程度的差異將病害分級(jí)賦值。植株不同病害程度分級(jí)參照陳勇等[17]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 誘變菌株X27-045的遺傳穩(wěn)定性

將X27-045轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上,菌株生長(zhǎng)3～4 d后將其再轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),作為第1代;重復(fù)上述步驟直到第10代,測(cè)定每代菌株4 d菌落直徑和14 d產(chǎn)孢量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件和Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析后進(jìn)行Duncan’s多重比較檢驗(yàn)差異(P<0.05),用Turkey法進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光誘變的尖角突臍孢菌株

從圖1和圖2可以看出:隨著誘變時(shí)間的增加,孢子在PDA平板上的菌落數(shù)逐漸減少,致死率逐漸增加,未經(jīng)紫外光照射的菌株X27菌落最多;當(dāng)紫外光照射時(shí)間為60 min時(shí),PDA平板上的菌落最少,致死率接近100%;當(dāng)紫外光照射時(shí)間為30 min時(shí),PDA平板上的菌落及其致死率次之。當(dāng)照射時(shí)間長(zhǎng)時(shí),致死率高(98.41%),在單位存活的菌株中負(fù)突變菌株較多,正突變菌株較少。照射時(shí)間短時(shí),致死率低(49.40%～77.69%),在單位存活的菌株中雖然正突變菌株較多,但數(shù)量多,篩選較困難。綜合考慮,選擇致死率為82.07%～96.81%的誘變時(shí)間作為最佳誘變時(shí)間范圍,即5～30 min。

圖1 紫外光照射72 h后X27的菌落圖

圖2 紫外光誘變時(shí)間與致死率的關(guān)系

從圖2可以看出,在最佳誘變時(shí)間范圍內(nèi),紫外光照射時(shí)間為30 min時(shí),孢子在PDA平板上形成菌落數(shù)最少,致死率為97.34%,存活菌株中為負(fù)突變菌株的比例較大,故不考慮30 min作為最佳誘變時(shí)間。紫外光照射時(shí)間分別為10、15、20 min時(shí),誘變后孢子在PDA平板上的菌落數(shù)相近,且其致死率也無顯著差異;紫外光照射時(shí)間為5 min時(shí),相比于其他處理差異顯著,且PDA平板上菌落數(shù)較多;紫外光照射時(shí)間為25 min時(shí),雖然致死率為95.82%,存活菌株可能存在負(fù)突變,但是相對(duì)于其他處理差異顯著,且PDA平板上菌落數(shù)適中,易于篩選。綜上所述,選擇尖角突臍孢菌的最佳誘變時(shí)間為25 min。

2.2 尖角突臍孢菌誘變株的篩選

2.2.1 誘變株產(chǎn)孢量在紫外光照射25 min后,共篩選出300株誘變菌株,編碼為:X27-UV001—X27-UV300,并篩選出45株產(chǎn)孢量較菌株X27顯著增加的誘變株(表1)。

表1 菌株X27與誘變菌株14 d產(chǎn)孢量比較

續(xù)表1 Table 1 continued

2.2.2 稗草離體葉片法測(cè)定誘變株的致病力將300個(gè)誘變株侵染離體稗草葉片后,測(cè)定病斑直徑,篩選出56株致病力較菌株X27顯著增加的誘變株(表2)。

從表1和表2可知:產(chǎn)孢量和致病力均高于原始菌株X27的誘變株共有19株,分別為X27-UV020、X27-UV039、X27-UV040、X27-UV041、X27-UV042、X27-UV045、X27-UV050、X27-UV086、X27-UV098、X27-UV114、X27-UV184、X27-UV215、X27-UV247、X27-UV248、X27-UV250、X27-UV281、X27-UV284、X27-UV286、X27-UV290。

表2 菌株X27與誘變菌株對(duì)稗草致病力比較

2.2.3 誘變株產(chǎn)孢量和致病力綜合聚類分析從圖3可知:第Ⅰ類群有47個(gè)誘變株,第Ⅱ類群有11個(gè)誘變株,第Ⅲ類群有24個(gè)誘變株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),產(chǎn)孢量高且致病力強(qiáng)的誘變株有17株,均分布于第Ⅰ類群中,僅有2株分布于第Ⅲ類群中,其他誘變菌株則屬于產(chǎn)孢量高或致病力強(qiáng)的菌株。

圖3 尖角突臍孢菌不同誘變株以產(chǎn)孢量和致病力觀測(cè)值為指標(biāo)的系統(tǒng)聚類(D2=10.0)

2.2.4 誘變株活體的侵染致病力從第Ⅰ類群中選出17株誘變菌株,然后從第Ⅱ、Ⅲ類群中分別選出 5株誘變菌株,最終作為侵染活體稗草的試驗(yàn)材料,并調(diào)查致病力。室內(nèi)活體稗草致病性結(jié)果(表3)表明,X27經(jīng)過誘變后對(duì)稗草的致病性明顯加強(qiáng)。高致病力誘變菌株X27-UV148、X27-UV048、X27-UV045、X27-UV286的致病力較X27(CK)高(P<0.05),其他誘變菌株致病力與X27(CK)差異不顯著。4株高致病力菌株對(duì)稗草的防治效果見圖4。

圖4 原始菌株與誘變菌株對(duì)稗草的防治效果(14 d)

表3 誘變菌株與菌株X27對(duì)活體稗草的致病性(室內(nèi)測(cè)定)

2.3 誘變株ITS-PCR擴(kuò)增

以ITS1和ITS4為引物,PCR擴(kuò)增出1條約為600 bp的特異性條帶(圖5)。將純化、回收的特異性條帶進(jìn)行測(cè)序,所得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中尖角突臍孢菌的ITS序列(登錄號(hào)為DQ337380)比對(duì),相似性高達(dá)98%,可以確定篩選出的4個(gè)誘變株均為尖角突臍孢菌。

圖5 誘變菌株和菌株X27的ITS序列擴(kuò)增片段電泳圖

2.4 尖角突臍孢菌誘變株的生物學(xué)特性

2.4.1 菌落的形態(tài)特征與菌落直徑從圖6可知:在28 ℃、PDA培養(yǎng)條件下,隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移,菌株X27和誘變株X27-UV286、X27-UV045、X27-UV048、X27-UV148菌落直徑不斷增加。培養(yǎng)3、5、7、9和11 d時(shí),誘變菌株X27-UV286、X27-UV045、X27-UV048、X27-UV148與菌株X27的菌落直徑差異均不顯著;從菌落形態(tài)上看,誘變菌株與菌株X27的菌落形態(tài)大體相同(圖7)。

圖6 誘變菌株和菌株X27菌落直徑

圖7 誘變菌株與對(duì)照菌株在28 ℃培養(yǎng)3 d時(shí)的菌落形態(tài)

2.4.2 尖角突臍孢菌誘變株的耐熱性從圖8可知:將菌株X27和誘變株X27-UV148、X27-UV048、X27-UV045、X27-UV286分別于10、15、20、25、28、30、32、37和40 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),各菌株的孢子萌發(fā)率均在30 ℃時(shí)達(dá)最高,40 ℃時(shí)各菌株孢子萌發(fā)率均最低。在10、15、20、25、28、32、37和40 ℃培養(yǎng),菌株X27和誘變株 X27-UV148 的孢子萌發(fā)率差異不顯著。在10、20 ℃培養(yǎng),菌株X27孢子萌發(fā)率顯著低于誘變株X27-UV048。在10 ℃培養(yǎng),菌株X27誘變株孢子萌發(fā)率顯著低于X27-UV045。在10、20、37 ℃培養(yǎng),菌株X27孢子萌發(fā)率顯著低于誘變株 X27-UV286。表明紫外光照射菌株的耐熱性發(fā)生了改變。相對(duì)于菌株X27來說,誘變株X27-UV148、X27-UV286對(duì)低溫、高溫的耐受能力均增強(qiáng);X27-UV048、X27-UV045對(duì)低溫耐受能力增強(qiáng)。

圖8 不同溫度下菌株X27和誘變菌株孢子萌發(fā)率

2.4.3 尖角突臍孢菌誘變株對(duì)紫外光的耐受力經(jīng)紫外光照射25 min后,UV-X27菌株的孢子萌發(fā)率顯著降低,而誘變株REX27-UV148和X27-UV148、REX27-UV048和X27-UV048、REX27-UV045和X27-UV045、REX27-UV286和X27-UV286的孢子萌發(fā)率差異均不顯著,表明誘變株REX27-UV148、REX27-UV048、REX27-UV045、REX27-UV286的抗紫外光能力明顯增強(qiáng)(圖9)。

圖9 不同培養(yǎng)時(shí)間菌株X27和誘變菌株紫外光照射25 min的孢子萌發(fā)率

2.5 尖角突臍孢菌誘變株的安全性

從表4可以看出:在供試的8種作物中,高粱對(duì)尖角突臍孢菌敏感,初期葉片上出現(xiàn)斑點(diǎn),2周后病斑并沒有擴(kuò)大趨勢(shì),被侵染的高粱能恢復(fù)生長(zhǎng)。其他7種作物對(duì)尖角突臍孢菌不敏感。處理后的2葉期稗草,植株枯萎死亡,說明尖角突臍孢菌的寄主范圍相對(duì)專一。

表4 高致病力誘變菌株對(duì)作物室內(nèi)安全性測(cè)定

2.6 誘變菌株X27-UV045的遺傳穩(wěn)定性

從表5可知:誘變菌株X27-UV045連續(xù)10代培養(yǎng)后,第10代與第1代培養(yǎng)3 d的菌落直徑差異不顯著,每代菌株菌落直徑基本穩(wěn)定,均值為2.30 cm;第10代與第1代菌株培養(yǎng)14 d的分生孢子產(chǎn)量無顯著差異,各代孢子產(chǎn)量保持穩(wěn)定,產(chǎn)孢量均值為3.54×106mL-1。菌株X27-UV0450經(jīng)過10代傳代培養(yǎng)后,菌絲生長(zhǎng)速率無明顯下降,分生孢子產(chǎn)量沒有出現(xiàn)退化。表明誘變菌株X27-UV045具有很好的遺傳穩(wěn)定性。

表5 誘變菌株X27-UV045連續(xù)10次的傳代培養(yǎng)

3 討論

在篩選誘變菌株時(shí),主要考慮的因素是篩選使目標(biāo)生物死亡率為50%左右的菌株,這可以在很大程度上得到正向突變的菌株[18]。本研究中,在設(shè)定最佳誘變時(shí)間范圍時(shí),以間隔大的時(shí)間段和菌株的死亡率來確定。試驗(yàn)結(jié)果顯示,在紫外光照射60 min后,菌株死亡率接近100%,菌株負(fù)突變比較大,不利于篩選;當(dāng)紫外光照射時(shí)間為1、3、5 min時(shí),存活菌株較多,不易篩選,故最佳誘變時(shí)間為5～30 min。采用確定最佳誘變時(shí)間范圍的方法,以5～30 min為最佳誘變時(shí)間。當(dāng)紫外光誘變菌株的死亡率為95%時(shí),可作為篩選的依據(jù)[19-21]。因此可以確定本次誘變的最佳時(shí)間為25 min。

菌株的優(yōu)良可以以產(chǎn)孢量和病情指數(shù)來判斷[22-23]。本研究以室內(nèi)產(chǎn)孢量、離體稗草葉片病斑測(cè)定以及活體稗草病情指數(shù)測(cè)定結(jié)果作為篩選依據(jù),最終從300個(gè)誘變菌株中,篩選出4株對(duì)稗草有強(qiáng)致病力的菌株,分別為X27-UV148、X27-UV286、X27-UV048、X27-UV045。篩選出的菌株病情指數(shù)顯著高于對(duì)照菌株X27,要想利用誘變株開發(fā)成稗草生防制劑,還需要對(duì)誘變株進(jìn)行親緣關(guān)系的測(cè)定,鑒定誘變后的優(yōu)勢(shì)菌株和菌株X27是同屬種的尖角突臍孢菌,確保生防制劑的有效活性成分能起特異性作用。ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))是真菌rRNA基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分,為高度可變區(qū),進(jìn)化速度較快,在真菌的屬間和種間變異豐富,真菌屬、種鑒定通常對(duì)該序列進(jìn)行測(cè)序[24]。ITS介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間,其在親緣關(guān)系近的物種之間長(zhǎng)度差異不大,而且序列在進(jìn)化過程中速度較快,因此被應(yīng)用于真菌系統(tǒng)分類及發(fā)育的研究[25-26]。在本研究中,4個(gè)誘變株和菌株X27的分子鑒定結(jié)果表明,菌株ITS序列的長(zhǎng)度約 600 bp,菌株之間相似度為98%,由此可以確定篩選出的4個(gè)誘變株均為尖角突臍孢菌。

真菌除草制劑是由活的孢子和活菌絲發(fā)揮作用,其常常受到各種非生物脅迫的阻礙,主要包括相對(duì)濕度、紫外光照射以及高溫[27-28]。篩選出的X27-UV148、X27-UV286、X27-UV048、X27-UV045誘變株產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率都比菌株X27要高,在PDA培養(yǎng)基上,誘變株X27-UV148、X27-UV286、X27-UV048、X27-UV045 和菌株X27的菌落差異不顯著,說明紫外光并不會(huì)對(duì)誘變株的菌落直徑以及菌落形態(tài)造成影響。

開發(fā)植物病原體作為微生物除草劑,大都是利用它們的專性寄生的特性,在應(yīng)用時(shí)首先應(yīng)該考慮的是對(duì)農(nóng)作物不致病[29]。本研究中,從對(duì)8種作物安全性測(cè)試的結(jié)果看,誘變后的尖角突臍孢菌與菌株X27均寄主單一,對(duì)其中7種作物均安全,對(duì)高粱僅僅是輕微侵染,這一結(jié)果和陳勇等[17]測(cè)定尖角突臍孢菌安全性的試驗(yàn)結(jié)果相同,但是對(duì)于玉米的結(jié)果卻相反,可能是因?yàn)橛衩灼贩N或玉米葉片蠟質(zhì)的原因而導(dǎo)致的,具體原因還需要進(jìn)一步研究。

微生物菌株的遺傳穩(wěn)定性在實(shí)際生產(chǎn)中非常重要,誘變菌株在傳代生產(chǎn)時(shí)可能伴隨突變或者退化的現(xiàn)象,從而導(dǎo)致已篩選出的誘變菌株出現(xiàn)性能衰退,因此有必要對(duì)誘變菌株進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng),以觀察其遺傳穩(wěn)定性[30]。本試驗(yàn)對(duì)X27-UV045進(jìn)行10代的傳代培養(yǎng),每1代的菌落直徑、產(chǎn)孢量基本保持穩(wěn)定,說明誘變獲得的菌株X27-UV045具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

綜上所述,4株誘變菌株具有開發(fā)為微生物生防制劑的潛力,相比原始菌株,更適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。然而本試驗(yàn)仍有不足之處:誘變菌株室外稗草防效是否與室內(nèi)防效結(jié)果一樣;原始菌株紫外光誘變后致病力提高的分子機(jī)制;開發(fā)適宜于尖角突臍孢菌的劑型應(yīng)用于田間試驗(yàn)。