王若男，熊興東，劉新光，曹 錕*（廣東醫(yī)科大學(xué).科研平臺服務(wù)管理中心；.衰老研究所，生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 53808）

肺炎鏈球菌是一種廣泛存在于自然界中的病原微生物，它們屬于革蘭陽性菌，尤其較多存在于動物糞便、人體的咽喉部位[1]。該菌能夠感染人體并造成感染性疾病，如呼吸道感染、鼻炎、扁桃體炎和肺炎等，也會對人體器官造成變態(tài)反應(yīng)，如腎小球腎炎、菌血癥、腦膜炎等重大疾病，對抵抗力較弱的嬰兒和老年人具有極強(qiáng)的殺傷性[2]。病原微生物對于動植物的危害仍未得到解決，這也是人類共同面對的難題之一，為了解決這些問題，越來越多的科研工作者投入到病原菌的致病機(jī)制研究當(dāng)中。

微量金屬元素是細(xì)菌生存和發(fā)揮毒力必不可少的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，它們通常作為金屬蛋白或酶類的相互作用底物，這些蛋白只有結(jié)合金屬離子之后才能激活其生理功能[3]。另外，金屬離子也能夠直接或間接參與細(xì)胞的生物合成和氧化應(yīng)激等代謝途徑，與病原微生物發(fā)揮粘附侵襲宿主細(xì)胞等生物功能密切相關(guān)。

本研究擬對肺炎鏈球菌R6中潛在的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Spr0934 進(jìn)行研究，采用多序列同源比對及生物信息學(xué)分析其活性中心的特點(diǎn)，通過分子對接技術(shù)測定該蛋白與鐵色素的結(jié)合位點(diǎn)，最后利用分子動力學(xué)模擬的方法研究apo Spr0934 和Fc-Spr0934 的穩(wěn)定性差異及其活性中心氨基酸殘基的變化，將分析二者的回旋半徑、溶劑可及表面積、均方根誤差、均方根波動值以及二級結(jié)構(gòu)含量等原子水平的指標(biāo)變化，為闡明該蛋白與鐵色素的相互作用機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)，并為開發(fā)基于金屬轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的抗菌藥物提供重要的靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 分子對接

本研究采用的是Ledock 分子對接軟件[4]（http://www.lephar.com/download.htm），Spr0934 的蛋白結(jié)構(gòu)（PDB:4h59）和鐵色素的結(jié)構(gòu)均來源于RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://www.rcsb.org/）。首先應(yīng)用VMD軟件對鐵色素的PDB 結(jié)構(gòu)生成mol2結(jié)構(gòu)，通過VMD軟件選定目標(biāo)蛋白Spr0934 的活性區(qū)域，即設(shè)置boxer xmin xmax ymin ymax zmin zmax。最后執(zhí)行分子對接ledock，并獲得配體分子的poses 及結(jié)合能量進(jìn)行分析。

1.2 分子動力學(xué)模擬

基于上述分子對接獲得的Fc-Spr0934 復(fù)合物以及apo Spr0934 結(jié)構(gòu)，采取Gromacs2020.4 軟件包分別對二者進(jìn)行計(jì)算生物學(xué)模擬。進(jìn)行分子模擬計(jì)算之前，需要先除去apo Spr0934 和Fc-Spr0934 結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶水和雜質(zhì)離子，設(shè)置兩個獨(dú)立的體系，采用SPC水模型、amber99sb-ildn 力場進(jìn)行總時長為30 ns 的仿真模擬。將apo Spr0934 和Fc-Spr0934 的蛋白結(jié)構(gòu)放置在立方周期盒中并作為起始構(gòu)象，設(shè)定蛋白與盒子邊界的最小距離為1.0 nm，模擬系統(tǒng)的周期性邊界條件適用于X/Y/Z 3 個方向[5]。溶膠中加入0.15 mol/L NaCl 鹽溶質(zhì)以便中和蛋白體系的電荷。采用蛙跳算法計(jì)算每個原子的運(yùn)動，用粒子網(wǎng)格法計(jì)算PME 靜電相互作用，利用最速下降能量法進(jìn)行400 步能量最小化，分別對apo Spr0934 和Fc-Spr0934 進(jìn)行50 ps 的位置約束模擬。正式動力學(xué)模擬的初速度被設(shè)置為隨機(jī)速度，以保證模擬的隨機(jī)性[6-7]。利用PyMOL、VMD以及Origin8.5軟件生成數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.3 分子模擬結(jié)果分析

利用VMD-1.9.1 軟件觀察兩個不同模擬體系的軌跡中蛋白構(gòu)象變化[8]，采用gmx rms、gmx rmsf 和gmx gyrate 工具分別計(jì)算蛋白的RMSD 變化、每個氨基酸殘基的α-C 的均方根漲落RMSF 以及回旋半徑Rg 值[9]。根據(jù)gmx distance分別測定apo Spr0934 和Fc-Spr0934 中鐵色素的直接相互作用的位點(diǎn)殘基（Asn-83、Tyr-133、Tyr-225 和Arg-231）的溶劑可及表面積SASA 值。并通過PyMOL 和Origin8.5 軟件分別繪制結(jié)構(gòu)圖與曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 分子對接預(yù)測Spr0934 的活性中心及鐵色素的結(jié)合位點(diǎn)

通過Ledock 的全局性對接，共得到15 個對接模型，其中8 個對接結(jié)果均呈現(xiàn)在同一個區(qū)域，且這些poses 的對接能量最低，說明該模型的合理性最高。此時，鐵色素被結(jié)合在Spr0934 的活性中心凹槽處，這與同源模板4HMQ的鐵色素結(jié)合區(qū)域基本一致（圖1A），說明此處為配體分子的優(yōu)勢結(jié)合區(qū)。與鐵色素結(jié)合的氨基酸殘基分為兩類，即直接和間接相互作用，其中Asn-83、Tyr-133、Tyr-225 和Arg-231 直接與鐵色素形成氫鍵結(jié)合，而Ala-82、Tyr-84、Trp-158 和Phe-255則起輔助作用（圖1B）。

圖1 分子對接結(jié)果的全局性展示

2.2 模擬過程中蛋白的均方根誤差及殘基的波動性分析

均方根誤差(root mean square deviation,RMSD)通常被用于監(jiān)測蛋白構(gòu)象與原始結(jié)構(gòu)之間的平均偏差，這是衡量體系是否達(dá)到平衡狀態(tài)的重要依據(jù)。蛋白整體構(gòu)象波動性結(jié)果表明，Spr0934 在結(jié)合鐵色素時的RSMD 值更低，大約在10 ns 即進(jìn)入相對平衡狀態(tài)（圖2A），apo Spr0934則在30 ns的模擬體系中則無法達(dá)到平衡，說明apo 蛋白不穩(wěn)定，而結(jié)合鐵色素能促使蛋白構(gòu)象穩(wěn)定。

統(tǒng)計(jì)每個原子相對于其平均位置的漲落（RMSF）值的變化，可以分析得出每個氨基酸殘基的靈活性差異。與apo Spr0934 相比，F(xiàn)c-Spr0934 的大多數(shù)殘基RMSF 值較?。▓D2B），尤其是與鐵色素存在相互作用的8 個氨基酸殘基更加穩(wěn)定。該結(jié)果說明，蛋白結(jié)合鐵色素之后不僅能引起結(jié)合位點(diǎn)殘基靈活性降低，而且能促使蛋白整體趨于穩(wěn)定。

圖2 蛋白整體構(gòu)象波動性及氨基酸殘基靈活性展示

2.3 蛋白的回旋半徑和溶劑可及表面積分析

分別統(tǒng)計(jì)兩個蛋白的回旋半徑（Rg）隨模擬時長的變化情況，Rg 值越大表示蛋白構(gòu)象靈活性較大，而該值越小則說明構(gòu)象越趨近于剛性。在apo Spr0934和Fc-Spr0934 的體系中，蛋白骨架α-C 的Rg 值在30 ns 時分別達(dá)到了2.07 nm 和2.04 nm（圖3A），說明apo形式的蛋白柔性較大故其對應(yīng)的Rg 也較高；而鐵色素被結(jié)合在活性中心后，蛋白整體則呈現(xiàn)出剛性即靈活性降低，該結(jié)果與常見的底物結(jié)合蛋白的特性相一致。溶劑可及表面積（SASA）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也說明了這一點(diǎn)，apo Spr0934 和Fc-Spr0934 蛋白整體構(gòu)象的SASA 值分別為154.5 nm2和147.9 nm2（圖3B）。然而，單獨(dú)統(tǒng)計(jì)與鐵色素直接相互作用殘基（Asn-83、Tyr-133、Tyr-225 和Arg-231）的SASA 值，發(fā) 現(xiàn)Fc-Spr0934 組 的SASA 值 為12.7 nm2，高 于apo Spr0934組的12.1 nm2（圖3C），這可能是由于蛋白的活性中心凹槽在apo 狀態(tài)下處于“closed”狀態(tài)，而結(jié)合鐵色素會造成其轉(zhuǎn)為“opened”狀態(tài)。

圖3 蛋白骨架的回旋半徑及溶劑可及表面積分析

2.4 apo Spr0934 和Fc-Spr0934 的二級結(jié)構(gòu)含量變化及構(gòu)象差異

為分析結(jié)合鐵色素對蛋白二級結(jié)構(gòu)含量造成的變化，筆者采用do_dssp 插件解析蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，apo Spr0934 蛋白結(jié)構(gòu)中平均有66 個殘基參與形成無規(guī)卷曲，99 個形成α 螺旋（圖4A）；而在Fc-Spr0934的結(jié)構(gòu)中平均有54個殘基參與形成無規(guī)卷曲，107 個則形成α 螺旋（圖4B）。該結(jié)果說明，鐵色素的結(jié)合將促使一部分無規(guī)卷曲含量向α螺旋轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)含量占比發(fā)生改變。為直觀反映出鐵色素結(jié)合導(dǎo)致的蛋白空間構(gòu)象變化，筆者分析了30 ns模擬時長內(nèi)apo Spr0934與Fc-Spr0934的平均結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示apo 形式的蛋白則更為松弛，而鐵色素結(jié)合蛋白整體更加緊湊（圖4C），這可能是由于鐵色素將活性中心凹槽附近的殘基距離拉近所致。

圖4 蛋白二級結(jié)構(gòu)含量變化及構(gòu)象差異

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是肺炎鏈球菌發(fā)揮粘附侵襲能力的關(guān)鍵[10]，然而自然界中常見的鐵源有血紅素、鐵色素、三價鐵離子及二價鐵離子等[11]。對于鐵色素結(jié)合蛋白的研究，有助于補(bǔ)充細(xì)菌的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。筆者針對肺炎鏈球菌R6 中的假定蛋白Spr0934進(jìn)行研究，通過分子對接技術(shù)篩選到鐵色素與蛋白結(jié)合的最佳構(gòu)型，確定了潛在的鐵色素結(jié)合位點(diǎn)殘基為Asn-83、Tyr-133、Tyr-225、Arg-231 和Ala-82、Tyr-84、Trp-158、Phe-255，其中前4 種為氫鍵形式結(jié)合，后4種為輔助形式結(jié)合。然后，通過分子動力學(xué)模擬優(yōu)化了復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并證實(shí)鐵色素的結(jié)合會導(dǎo)致蛋白質(zhì)整體的RMSD、RMSF、Rg 及SASA 值降低，這將促使復(fù)合物蛋白的穩(wěn)定性升高。鐵色素的結(jié)合將導(dǎo)致蛋白二級結(jié)構(gòu)組分占比發(fā)生改變，即促使一部分無規(guī)卷曲含量向α 螺旋轉(zhuǎn)變?？傊?，本研究在原子水平上揭示了Spr0934 與鐵色素的相互作用機(jī)制，為以該蛋白為靶標(biāo)設(shè)計(jì)抗菌藥物提供了理論基礎(chǔ)。