王理槐，孫銀輝，張領兄，劉 歡，周 琴，袁蘇云，張亞茹，朱 樂，張 紅

(1. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2. 湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；3. 重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院，重慶 400000)

肺癌是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在我國都位居惡性腫瘤之首[1]。肺癌的類型以非小細胞肺癌常見，占肺癌的80%以上[2]。中醫(yī)認為非小細胞肺癌屬于“肺積”“咯血”范疇，由于正氣虛損、陰陽失調(diào)，邪毒外侵入肺，導致痰濁內(nèi)聚、氣滯血虛、肺氣郁阻，肺功能失調(diào)，日久形成肺部積塊。因此，肺癌的主要病機為氣滯、血瘀、毒凝[3-4]。血府逐瘀湯具有活血化瘀、行氣止痛兼清熱的功效，用于中晚期非小細胞肺癌可明顯改善血液高凝狀態(tài)，減輕癥狀，提高近期療效[5-6]，但其作用機制不明確。本研究基于與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的Wnt/β-catenin信號通路，觀察了血府逐瘀湯對非小細胞肺癌荷瘤小鼠糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)與β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達的影響，探討其治療非小細胞肺癌的作用及可能機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性健康SPF級8周齡C57BL/6小鼠32只，體重(23.16±1.38)g，購于湖南嘉泰實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2020-0006。所有小鼠均于恒溫(21～22 ℃)、恒濕(55%～65%)，安靜通風的動物飼養(yǎng)室內(nèi)行適應性飼養(yǎng)(喂食標準飼料和蒸餾水)。

1.2實驗細胞 人非小細胞肺癌 A549細胞，購于中國醫(yī)學科學院細胞庫。

1.3實驗藥物 血府逐瘀湯由湖南中醫(yī)藥大學校醫(yī)院藥劑科提供，組方：桃仁12 g，紅花、當歸、生地黃、牛膝各9 g，川芎、桔梗各5 g，赤芍、枳殼各6 g，柴胡、甘草各3 g。準確稱取劑量，經(jīng)煎藥機煮成湯劑，濃縮成含生藥1 g/mL。

1.4實驗方法 將人非小細胞肺癌 A549細胞解凍復蘇后接種于培養(yǎng)基上，待其培養(yǎng)至對數(shù)生長期后用0.25%胰蛋白酶消化，再以1200r/min離心10 min，制成單細胞懸液，磷酸鹽緩沖液重懸，并將細胞濃度調(diào)整為1×107個/mL。在小鼠右側(cè)腋皮下接種0.2 mL細胞懸液，待腫瘤體積生長至100 mm3左右，將小鼠隨機分為4組，每組8只。模型組給予生理鹽水5 mL/kg腹腔注射和蒸餾水5 mL/kg灌胃，血府逐瘀湯低、中、高劑量組均在腹腔注射生理鹽水5 mL/kg后再分別予以血府逐瘀湯12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg灌胃，均1次/d，連續(xù)14 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1瘤重、腫瘤體積、生長抑制率 小鼠脫頸處死后盡量完整剝?nèi)∧[瘤，稱重，計數(shù)腫瘤體積和生長抑制率。 腫瘤體積=π×腫瘤組織長徑×短徑2/6。生長抑制率=(1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。

1.5.2腫瘤組織細胞凋亡率 采用流式細胞術檢測：取1/3瘤體組織，用眼科剪剪碎后，以1 000 r/min離心5 min，取細胞懸液，再次離心取細胞沉淀，采用預冷的PBS重懸，采用annexin V碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)，嚴格按說明書中步驟操作，采用結(jié)合緩沖液重懸細胞并避光反應10 min，之后滴加PI，4 ℃孵育30 min。使用BD Accuri C6 (BD Biosciences,San Jose,CA)流式細胞儀，在488 nm的激發(fā)下分析細胞早期和晚期凋亡情況。分別在530/30 nm和585/40 nm的發(fā)射通道中采集經(jīng)FITC和PI染色的細胞熒光信號，結(jié)果用FCS Express V4軟件(De Novo software,Glendale,CA)進行處理。

1.5.3腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白表達情況 采用Western blot檢測：提取小鼠腫瘤組織蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉室溫封閉，分別加入兔源GSK-3β一抗(1∶1 500)、兔源β-catenin一抗(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育，ECL顯影，ChemiDoc MP成像。運用Adobe Photoshop CS5軟件分析蛋白條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參。

1.5.4腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin mRNA表達情況 采用qTR-PCR檢測：提取小鼠腫瘤組織，采用組織研磨儀研磨制備細胞懸液。根據(jù)組織RNA提取試劑盒提取，參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參。相關引物序列：GSK-3β 上游引物5’-AGGCTGTGTGTTGGCTGAAT-3’，下游引物5’-TTTGCTCCCTTGTTGGTGTT-3’；β-catenin上游引物5’-GTTACGGCAATCAGGAAAGC-3’，下游引物5’-GACAGACAGCACCTTCAGCA-3’；GAPDH上游引物5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’，下游引物5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。PCR擴增條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃復性30 s，共循環(huán)40次。使用相對量化方程2-ΔΔCt計算相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠瘤重、腫瘤體積和生長抑制率比較血府逐瘀湯各劑量組瘤重、腫瘤體積均明顯低于模型組(P均<0.05)；血府逐瘀湯各劑量組瘤重、腫瘤體積呈劑量依賴性降低，生長抑制率呈劑量依賴性增高，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組非小細胞肺癌荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積和生長抑制率比較

2.2各組小鼠腫瘤組織細胞凋亡率比較 血府逐瘀湯各劑量組細胞凋亡率均明顯高于模型組(P均<0.05)，且血府逐瘀湯各劑量組細胞凋亡率呈劑量依賴性增高，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 流式細胞術檢測各組非小細胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡情況

圖2 各組非小細胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡率

2.3各組小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白表達情況比較 血府逐瘀湯各劑量組腫瘤組織中GSK-3β蛋白相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，β-catenin蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且血府逐瘀湯各劑量組GSK-3β與β-catenin蛋白相對表達量分別呈劑量依賴性增高和降低，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 各組非小細胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白表達情況

圖4 各組非小細胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin蛋白相對表達量

2.4各組小鼠GSK-3β與β-catenin mRNA表達量比較 血府逐瘀湯各劑量組腫瘤組織中GSK-3β mRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，β-catenin mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且血府逐瘀湯各劑量組GSK-3β與β-catenin mRNA相對表達量分別呈劑量依賴性增高和降低，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖5。

圖5 各組非小細胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中GSK-3β與β-catenin mRNA相對表達量

3 討 論

中醫(yī)認為，正氣內(nèi)虛，肺氣虧損，外邪侵入，客邪留滯不去，致肺部血瘀氣滯，結(jié)而成塊；或煙毒內(nèi)侵，熱灼津液，陰液內(nèi)耗，致肺陰虧損，久則氣陰虧虛，而致痰濕瘀血凝結(jié)；或邪毒侵肺，毒瘀互結(jié)，久則形成腫塊；或痰濕聚肺，肺氣宣降失常，導致氣血瘀阻。故而正氣內(nèi)虛、陰陽失調(diào)是導致非小細胞肺癌的內(nèi)因，邪毒內(nèi)侵是外因，氣滯、血瘀、痰凝、毒聚是病理產(chǎn)物[7-8]。血府逐瘀湯方中桃仁、紅花破血行氣、化瘀止痛；牛膝活血通經(jīng)，引血下行；赤芍、川芎活血行氣，助桃仁、紅花活血化瘀止痛；柴胡疏肝解郁，兼升清陽，同桔梗、枳殼共用理氣去滯作用尤佳，且可載藥上行，使藥效達于胸肺；生地、當歸養(yǎng)血益陰又具清熱之功，避免藥性溫燥；甘草調(diào)和諸藥。全方活血化瘀、行氣，血行瘀化有利于新血復生，氣血和調(diào)，改善機體氣滯、血瘀、痰凝、毒聚。張嵐等[9]報道，生脈飲合血府逐瘀湯加減治療可明顯改善非小細胞肺癌患者血液的高凝狀態(tài)，可通過下調(diào)堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平達到抗腫瘤的效果。本課題組通過制備肺癌荷瘤小鼠模型進行研究，結(jié)果顯示血府逐瘀湯各劑量組瘤重、腫瘤體積均明顯低于模型組，且各劑量組瘤重、腫瘤體積呈劑量依賴性降低，生長抑制率呈劑量依賴性增高。說明血府逐瘀湯能夠有效抑制非小細胞肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織生長，促進腫瘤細胞凋亡，且作用與血府逐瘀湯劑量有一定關系。

GSK-3β是Wnt/β-catenin信號通路中的一種重要激酶，能夠抑制通路的信號傳導[10-11]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵分子，在細胞的增殖、侵襲和凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。肺癌干細胞中Wnt/β-catenin通路活性上調(diào),GSK-3β表達水平下降,p-GSK3β(Ser9)和β-catenin表達水平上升，GSK-3β能夠調(diào)控β-catenin在細胞質(zhì)內(nèi)的磷酸化和降解，上調(diào)GSK-3β有利于抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，促進肺癌細胞發(fā)生凋亡[13-14]。方煒等[15]通過檢測肺癌組織標本中Wnt、β-catenin、c-myc蛋白及mRNA表達情況發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin/c-myc通路活化程度與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間存在密切關系。本實驗結(jié)果顯示，血府逐瘀湯各劑量組腫瘤組織中GSK-3β蛋白及mRNA相對表達量均明顯高于模型組，β-catenin蛋白及mRNA相對表達量均明顯低于模型組，且各劑量組GSK-3β和β-catenin蛋白及mRNA相對表達量呈劑量依賴性增高和降低。說明血府逐瘀湯能夠上調(diào)GSK-3β表達，下調(diào)β-catenin表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性。

綜上所述，血府逐瘀湯可能通過上調(diào)GSK-3β表達，下調(diào)β-catenin表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性達到抑制腫瘤組織生長和促進腫瘤細胞凋亡的作用，且作用與血府逐瘀湯劑量有一定關系。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。