張雅穎，侯雨希，劉日，尹偉，彭雯佳，弓靜

1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院（長海醫(yī)院）放射科（上海，200433）

2.同濟大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院放射科（上海，200434）

0 引言

計算機斷層掃描（CT）是臨床最常用的診斷成像技術(shù)之一。由于軟組織間缺乏足夠的對比度［1］，為區(qū)分軟組織密度間的細微變化，往往依賴CT 增強造影來增加軟組織間的對比度。臨床使用的造影劑主要是碘基小分子，具有以下缺點：對腎毒性相對較高；成像時間短和成像無特異性［2］。這些缺點限制了CT 作為分子影像學(xué)手段的廣泛應(yīng)用。近年來隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米尺寸的CT 造影劑開發(fā)得到了極大的推動。金納米粒子比碘造影劑具有更好的X 線衰減值，更長的血液循環(huán)時間，并且金納米粒子具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，可以被各種功能分子修飾［1，3-4］。通過聚乙二醇（PEG）進行修飾，可以提高AuNP 的穩(wěn)定性［5-6］。本研究目的在于將不同濃度的PEGlatedAuNPs 進行體外CT 掃描，與目前臨床通用的非離子型碘造影劑—碘普羅胺（Iopromide）進行衰減系數(shù)和成像能力比較；然后通過皮下注入和靜脈注射兩種方式進行動物體內(nèi)CT 的掃描，進行PEGlatedAuNPs作為新型CT 造影劑的初步影像學(xué)實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品與試劑：溴化十六烷銨（CTAB，國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司），氯金酸（HAuCl4）、硼氫化鈉（NaBH4）、硝酸銀（AgNO3）、抗壞血酸（美國Sigma-Aldrich 公司），聚乙二醇（PEG，西安瑞禧生物科技有限公司），優(yōu)維顯370（碘普羅胺，Iopromide，拜耳醫(yī)藥保健有限公司），異氟烷（Isoflurane，購自河北九派制藥有限公司）。

1.1.2 實驗動物：SD 大鼠7 只，雄性，體重250～300 g，第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心。

1.1.3 實驗儀器：256 層螺旋CT 機(Brilliance iCT；Philips heathcare；clevelandohio；USA)，動物氣麻機（MSS-3，上海任誼生物科技有限公司），自制樣本掃描架。

1.2 方法

1.2.1 PEG 包裹納米金粒子（PEGlatedAuNPs）的制備

采用晶種生長法制備金納米粒子溶液，首先進行金種子液的制備，將5 mL 0.2 moL/L CTAB溶液加入到5 mL 5*10～4 moL/L HAuCl4溶液中，于28℃水浴中攪拌搖勻，然后緩慢加入冰冷的0.6 mL 0.01 moL/L NaBH4溶液作為還原液得到金種子液，待用。25 mL 0.2 moL/L CTAB 溶液加入750 μL 4 *10～3 moL/L AgNO3溶液與25 mL 1*10～3 moL/L HAuCl4溶液的混合液中，于28℃水浴中攪拌搖勻，然后緩慢加入350 μL 8*10～2 moL/L 抗壞血酸，得到生長液。最后將60 μL 的種子液加入到50 mL 的生長液中混合，震蕩搖勻經(jīng)生長2 h，即得到了納米金顆粒（納米金棒）原液。原液經(jīng)過離心2 次（1×104r/min，10 min）純化棄上清液后去除表面活性劑，收集濃縮的納米金棒，重懸在去離子水中，繼續(xù)震蕩2 h，得純化的納米金粒。為避免納米金粒子在體內(nèi)聚集，接下來加入PEG（polyethylene glycol）衍生物進行表面修飾包裹。

1.2.2 納米表征測定

使用紫外可見分光光度計檢測的金納米粒子溶液的光吸收譜。用透射電鏡（TEM）觀察納米金粒子形態(tài)。TEM 圖像在200 kV，放大倍數(shù)為80 000 倍。

1.2.3 體外CT 掃描及CT 值測定

離心純化的AuNPs 粒子懸液和CT 造影劑碘普羅胺用去離子水稀釋配置成梯度濃度，依次為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL，共7個濃度。純陰性對照組采用去離子水。將裝有純水、AuNPs 粒子懸液和碘普羅胺梯度液的離心管按濃度梯度擺放于管架上，浸入裝有去離子水的玻璃皿中，擺放于CT 掃描臺上，行CT 掃描，掃描參數(shù)為：管電壓=80 kV，管電流=300 mAs，掃描視野=180 mm×180 mm，矩陣=512×512，層厚=0.8 mm，層間距=0.4 mm。三名有經(jīng)驗的放射科醫(yī)師取相同層面勾畫相同面積的ROI，測量每管樣品的CT 值，取三者測量結(jié)果的平均數(shù)代表樣品CT 值。

1.2.4 體內(nèi)CT 成像

1 只健康成年SD 大鼠氣麻機異戊烷麻醉后固定，行皮下注射掃描，將配置好的梯度濃度的納米金粒子、碘普羅胺稀釋液按順序分別注射于左右腹部距中線2 cm 處皮下，注射劑量為10 μL。皮下注射后30 s、1 min、3 min、10 min、1 h、6 h、24 h、4 d、5 d 進行CT 掃描。CT 掃描參數(shù)：80 kV，300 mAs，轉(zhuǎn)速0.5 s，準直寬度32×0.625 mm，PEGlatedAuNPs 體內(nèi)成像6 只健康成年SD 大鼠隨機分為AuNPs 實驗組、Iopromide 對照組。實驗組、對照組均以5 mg/kg 的劑量，經(jīng)尾靜脈緩慢注射AuNPs 對比劑和Iopromide。注射后15 s、30 s、5 min、30 min、1 h、2 h、4 h、24 h、36 h、48 h 進行CT 掃描，掃描參數(shù)同上，對比分析注射前后不同延遲時間段掃描結(jié)果，評估對比PEGlatedAuNPs、Iopromide 對各組織的增強能力及體內(nèi)循環(huán)時間。

2 結(jié)果

2.1 PEGlatedAuNPs 的表征

合成的納米金粒子實際上為棒狀結(jié)構(gòu)，也稱為納米金棒（gold nanorods，GNRS），其粒徑均勻，分散性好，長徑約為50～60 nm，短徑約為20～30 nm（見圖1），納米金棒的光吸收曲線上其紫外吸收峰有2 個峰值，位置分別在520 nm 和690 nm 左右（見圖2）。

圖1 納米金粒子的TEM 形貌特征Fig.1 Transmission electron microscope morphology of gold

圖2 納米金粒子的光吸收曲線Fig.2 Optical absorption curves of gold nanorods

2.2 體外CT 成像及CT 值測量

三名有經(jīng)驗的放射科醫(yī)師獨立測量梯度濃度的PEGlatedAuNPs 粒子懸液和Iopromide 溶液的CT值。同時繪制CT 值隨溶液濃度變化曲線，如圖3(a) 所示，PEGlatedAuNPs 粒子懸液和Iopromide溶液的CT 值隨著濃度的升高而升高，并呈線性相關(guān)。當(dāng)濃度≤0.2 mg/mL 時PEGlatedAuNPs 粒子懸液的CT 值略低于相同濃度的Iopromide 溶液；當(dāng)濃度＞0.2 mg/mL 時，PEGlatedAuNPs 粒子懸液的CT 值高于相同濃度的Iopromide 溶液，且隨著濃度的增加兩者CT 值差異越來越大。不同梯度濃度的CT 灰度圖如圖3(b) 所示。

圖3 CT 值隨濃度變化規(guī)律Fig.3 Variation law of CT value with concentration

2.3 體內(nèi)CT 成像

2.3.1 當(dāng)梯度濃度為0.2～2.0 mg/mL 的PEGlated-AuNPs 粒子懸液和Iopromide 溶液注入SD 大鼠腹部皮下后，CT 可見皮下注射點周圍形成高密度小點或片狀高密度影，且局部CT 值隨濃度升高而增加。形態(tài)上，PEGlatedAuNPs 呈球形或梭形，形態(tài)較為固定（圖4）。Iopromide 呈散在的條形，分布范圍較AuNPs 廣。造影劑的吸收與消散情況，圖4 (a)、(b)、(c) 箭頭所指為皮下注射2 mg/mL 的Iopromide 造影劑的0 s、30 s、3 min 圖像，0 s 時呈稍高密度條狀影，30 s 呈散射條形等密度影，3 min 皮下造影劑團完全消散，同時觀察到SD 大鼠的腎盂逐漸變亮，而小鼠對側(cè)皮下同濃度的PEGlatedAuNPs 則一直為明亮的球形高密度影，在隨后加掃的4 d［圖4(e)］及5 d［圖4(f)］圖像，PEGlatedAuNPs 一直可見，但5 d 左右類圓形致密影周圍可見條狀向周圍引流的高密度影。另外，研究中發(fā)現(xiàn)濃度達到0.4 mg/mL 的PEGlatedAuNPs就可以被肉眼分辯出來圖4(d)。

圖4 梯度濃度PEGlatedAuNPs、Iopromide 皮下注射CT 圖Fig.4 CT images of configured gradient concentration of PEGlated AuNPs and Iopromide after injection

2.3.2 鼠尾靜脈注射將0.5 mg/mL 的PEGlatedAuNPs和Iopromide 造影劑以相同劑量（5 mg/kg）經(jīng)鼠尾靜脈緩慢注射到SD 大鼠體內(nèi)，并行多時間點CT 掃描檢測其肝腎膀胱的CT 值變化。Iopromide組的SD 鼠各器官的未見明顯強化。而腎臟和膀胱30 s 就開始逐漸變亮，說明Iopromide 經(jīng)腎臟迅速代謝（圖5）。而PEGlatedAuNPs 組，鼠尾靜脈造影劑注射后24 h 肝臟仍無明顯強化，在36 h 時達到強化最高點，CT 值約82.3±3.7 Hu，之后至48 h，CT 值緩慢逐漸恢復(fù)為正常，說明PEGlatedAuNPs 有很好的體內(nèi)相容性及明顯高于其他造影劑體內(nèi)循環(huán)時間（圖5～圖6）。而腎臟強化不明顯說明PEGlatedAuNPs 主要代謝途徑不是腎臟代謝。

圖5 PEGlatedAuNPs(0.5mg/mL)的體內(nèi)成像Fig.5 PEGlated AuNPs(0.5mg/mL) in vivo

圖6 PEGlatedAuNPs 經(jīng)鼠尾靜脈注射后各臟器CT 值隨時間的變化Fig.6 The change of CT values of PEGlated AuNPs injected into tail vein in different organs with time

3 討論

CT 成像具有良好的空間分辨率及快速的掃描速度，盡管CT 的對比分辨率遠遠高于傳統(tǒng)的X線攝影，但由于大多數(shù)軟組織具有相似的CT 值（0～50 Hu），仍然難以區(qū)分軟組織密度的細微變化［1］。，往往依賴CT 造影來增加軟組織間的對比度。盡管碘造影劑經(jīng)歷了多個發(fā)展階段也克服了很多的臨床困難［7-9］，例如，非離子型與細胞膜，肽和其他生物結(jié)構(gòu)相互作用的趨勢較低，因此它們的毒性小于離子型［9］。二聚體比單體顯示出更低的滲透壓，這降低了注射部位的疼痛和熱感，并降低了造影劑誘導(dǎo)的腎毒性（CMN）的發(fā)生率［4］。但是市售的造影劑如：碘普羅胺、碘海醇等，仍具有以下缺點：腎毒性相對較高；成像時間短和成像無特異性［10］，另外小分子物質(zhì)不易進行表面修飾，所有這些缺點限制了它們在CT分子影像中的應(yīng)用。近年來隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米尺寸的高原子序數(shù)CT 造影劑開發(fā)得到了極大的推動，其中比較有代表性的為：氧化鉭納米粒子［11-12］、硫化鉍納米粒子［13］和金納米粒［1，3，4］。金納米粒子比碘造影劑具有更好地X 線衰減值，更長的血液循環(huán)時間，并且金納米粒子具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性。

3.1 PEG 與AuNPs 的生物相容性

金納米粒子具有良好的生物相容性和毒性(半數(shù)致死量為3.2 g/kg)［3，14-15］。由于裸露的金納米粒容易聚集、沉淀，會造成在生物組織部位嚴重的非特異性吸附，從而影響實驗結(jié)果評價，因此表面要經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎検蛊渚哂辛己玫姆稚⑿裕黾臃€(wěn)定性。而目前應(yīng)用較為廣泛的為 PEG（聚乙二醇），PEG 已經(jīng)通過 FDA 批準用于臨床，又因巰基與金納米粒（AuNPs）Au-S 之間具有很強的共價結(jié)合作用［5］，故采用巰基化的 PEG(SH-PEG) 可以增加金納米粒的穩(wěn)定性［5-6］，SH-PEG 進行表面修飾后金納米粒具有較好的水溶性，生物相容性好，所以這種新型 CT 造影劑由高密度金納米粒組成內(nèi)核，外修飾 SH-PEG 后可以增加納米粒的穩(wěn)定性及生物相容性，可以大大延長循環(huán)時間。本研究中皮下注射及靜脈注射PEGlatedAuNPs 造影劑的4 只健康SD 大鼠均未見死亡，且生存狀態(tài)良好，與先前研究表明的良好生物相容性結(jié)果一致。

3.2 PEGlated AuNPs 的體外成像

CT 掃描成像基于不同組織間 X 線衰減率差別，而 X 線衰減率則是由組織的原子序數(shù)、組織密度和電子密度三者共同決定的。迄今為止，臨床上使用的X 射線造影劑主要由小分子碘化合物組成，為實現(xiàn)良好造影需要的大劑量造影劑注射體內(nèi)，這些分子可能會導(dǎo)致一些患者的嚴重副作用（例如過敏、心血管疾病和腎毒性）。眾所周知，高原子系數(shù)元素X 線衰減率高，因此人們對利用高原子序數(shù)元素（例如金、鉍、鐿和鉭）開發(fā)新型X 射線造影劑開發(fā)越來越感興趣。金作為一種高原子序數(shù)和電子密度（金原子序數(shù)為 79，金電子密度 19.32 g/cm3）的金屬材料，較常規(guī)的碘造影劑（碘原子序數(shù) 53，碘電子密度 4.9 g/cm3），金具有更高 X線衰減率，同摩爾濃度情況下其X 線衰減率是常規(guī)碘造影劑的 3 倍左右，增強顯影效果更好［3，5，16］。本研究體外實驗發(fā)現(xiàn)，在80 kV，300 mAs 的掃描條件下，隨著濃度增加，PEGlatedAuNPs 粒子懸液與PEGlatedAuNPs 粒子懸液的CT 值均增加，濃度＞0.2 mg/mL 時，我們此次制備的PEGlatedAuNPs粒子懸液的CT 值即高于相同濃度的Iopromide 溶液，濃度＞0.4 mg/mL 時可以產(chǎn)生肉眼可辯的密度差別（CT 值相差約20 Hu），濃度等于0.8 mg/mL 時，PEGlatedAuNPs 粒子懸液幾乎為相同濃度的Iopromide 溶液的兩倍，且隨著濃度的增加兩者CT 值差異越來越大，與以往的金納米粒子體外研究結(jié)果基本一致［3，17-18］。說明金納米粒子的成像能力優(yōu)于同濃度的碘溶液，其衰減系數(shù)高，這也是金納米粒子作為CT 造影劑得以應(yīng)用的首要條件，也是最基本的要求。

3.3 PEGlatedAuNPs 的體內(nèi)成像

在體內(nèi)皮下注射實驗中我們發(fā)現(xiàn)，碘造影劑雖為高密度物質(zhì)，但因其為小分子物質(zhì)，容易在組織間分散成條片狀，并極快進入血液循環(huán)代謝而逐漸降低密度，導(dǎo)致皮下停留時間極短，數(shù)分鐘內(nèi)即被清除而無影可尋。PEGlatedAuNPs 粒子懸液較碘形態(tài)更規(guī)則，始終表現(xiàn)為點狀的高密度影，不易在皮下離散，我們猜測是由于兩者的表面張力存在差異所致，并且在隨后多個時間點CT 掃描發(fā)現(xiàn)皮下金溶液的CT 值有所上升，我們考慮是其液性成分被組織間隙吸收所致，并且在5 d 后≥0.4 mg/mL 濃度的皮下金溶液仍然可見，而本次研究所制得PEGlatedAuNPs 長徑約為50～60 nm，短徑為20～30 nm，在皮下能長時間停留而不易被內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，5 d 后才開始逐漸向周圍組織條狀擴散，是一種理想的原位注射示蹤劑，如果應(yīng)用于表淺腫瘤的注射或者皮下種植瘤的注射，將來可以應(yīng)用CT 來查看金納米粒子在腫瘤部位的聚集與消散情況監(jiān)測腫瘤的生長消散情況，又可以利用其在腫瘤原位長期存留不易消散的特性，再利用金納米粒子的“ 光熱效應(yīng)”［19-20］的物理特征，通過近紅外線開展腫瘤的光熱治療，使金納米粒聚集的腫瘤部位迅速升溫來實現(xiàn)腫瘤的精準治療而不損傷周圍正常的組織。本研究所制備的金納米粒及其體內(nèi)皮下注射的分布形態(tài)和特點，說明金納米粒子除了優(yōu)越的衰減系數(shù)應(yīng)用于X 射線成像之外［21］，還可以在腫瘤的原位注射監(jiān)測生長、腫瘤的精準光熱治療、誘導(dǎo)腫瘤凋亡等方面［22-24］有更廣泛的應(yīng)用。

隨著納米技術(shù)的進步，2006 年Hainfeld［3］在體內(nèi)首次應(yīng)用金納米粒作為 CT 造影劑應(yīng)用于血管成像，之后陸續(xù)有實驗證明的直徑在 1～100 nm 的金納米粒，因為表面更容易被修飾、攜帶靶向分子且無毒［16］、體內(nèi)生物相容性好、體內(nèi)循環(huán)時間長［5］，是一種理想的 CT 造影劑物質(zhì)。本研究所用的PEGlatedAuNPs 粒徑均勻，分散性好，在體內(nèi)鼠尾靜脈造影劑注射實驗中我們發(fā)現(xiàn)PEGlatedAuNPs 的在肝臟顯像達峰時間為36 h，而腎臟基本未見強化，也證實了金納米粒子體內(nèi)循環(huán)時間長，主要經(jīng)肝臟代謝的特點，作為CT 造影劑可以很好地克服碘造影劑腎毒性和循環(huán)時間短的缺點。根據(jù)Hainfield［3］報道，該團隊采用1.9 nm直徑的AuNPs，以2.7 g/kg 的劑量經(jīng)鼠尾靜脈注射濃度為270 mg/mL 的AuNPs 可以實現(xiàn)血管和血池的良好顯像，但我們的研究考慮到經(jīng)濟成本，金的濃度和總量比較低，緩慢注入后迅速被血液稀釋而無法使血池顯示成高密度。就金納米粒子的體內(nèi)代謝和碘溶液的體內(nèi)代謝而言，碘造影劑容易做到血池顯像，而金納米粒子的優(yōu)勢并不在于血池顯像，而在于其可以在較小的用量下就能實現(xiàn)良好的器官顯像，如果攜帶特定的功能基團可以實現(xiàn)器官或者組織的靶成像。

綜上所述，本次研究所制備的PEGlatedAuNPs粒子作為新型CT 造影劑，具有高 X 線衰減率，體內(nèi)生物相容性好，體內(nèi)循環(huán)時間長的特點。此外，可用各種靶向配體（例如，葉酸，RGD 肽，抗體）進一步功能化PEGlatedAuNPs 粒子，實現(xiàn)CT 分子成像，利用其光熱效應(yīng)又可以實現(xiàn)腫瘤的精準治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。