王曉玲，李慶飛，原讓花，王夢(mèng)夢(mèng)，肖 艷，董彥琪，常懷成，張倩倩

（1.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453000； 2.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

在十字花科作物大白菜的雜交優(yōu)勢(shì)育種中，利用其雄性不育系雜交育種是一條非常重要的途徑。雄性不育性在高等植物中普遍存在，雄性不育可以分為細(xì)胞質(zhì)不育型、細(xì)胞核不育型和核質(zhì)互作不育型3 種類型。由于大白菜資源中沒(méi)有細(xì)胞質(zhì)雄性不育源，生產(chǎn)中使用的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系均來(lái)源于異源細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)雄性不育系主要有3種類型：蘿卜Ogura CMS、甘藍(lán)型油菜Polima CMS和甘藍(lán)型油菜nap CMS。雄性不育系的花粉由于受多種因素的影響，花粉不能正常的發(fā)育或者沒(méi)有生活力，雄蕊的敗育會(huì)因品種或類型的不同而有所差異，不同大白菜材料的CMS 和保持系的線粒體DNA 的RFLP、RAPD 和AFLP 呈多態(tài)性，CMS 和保持系的線粒體基因組結(jié)構(gòu)也存在著顯著差異。產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的分子機(jī)制主要有兩種：一是線粒體DNA 產(chǎn)生新的閱讀框（open reading fragment，ORF），產(chǎn)生有毒的蛋白，從而影響到線粒體的正常功能；二是與線粒體雄性不育有關(guān)的基因與正常線粒體基因重組或共表達(dá)，直接或間接影響正常基因的功能，產(chǎn)生雄性不育。如在Ogura 型蘿卜中發(fā)現(xiàn)的orf138、nap 甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)的orf222、Polima 型油菜中發(fā)現(xiàn)的orf224、葉用芥菜中發(fā)現(xiàn)的orf220等都是在不育系材料中發(fā)現(xiàn)的與不育性相關(guān)的開(kāi)放閱讀框。

細(xì)胞和組織在離開(kāi)機(jī)體后很快會(huì)發(fā)生溶解和腐敗，很難維持它原有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，因此，通過(guò)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色等步驟制作石蠟切片可免使細(xì)胞組織死去，以便于后期進(jìn)行觀察分析。

本試驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上，探求大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育發(fā)生的時(shí)期及其特點(diǎn)，對(duì)現(xiàn)有的不育系材料進(jìn)行鑒定分類和細(xì)胞學(xué)觀察。采用同源序列基因擴(kuò)增技術(shù)，依據(jù)與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的線粒體嵌合基因orf224、orf138、orf222 設(shè)計(jì)出3 對(duì)引物，對(duì)3種大白菜花蕾粒線粒體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得差異片段，并通過(guò)電泳試驗(yàn)對(duì)大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的類型進(jìn)行鑒定；繼而采用石蠟切片的方法，用光學(xué)顯微鏡觀察花蕾在不同長(zhǎng)度時(shí)花藥的發(fā)育程度。為細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在大白菜新品種選育中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)采用3個(gè)不育系及相對(duì)應(yīng)的保持系（表1）。

表1 6 個(gè)大白菜花蕾樣本的編號(hào)、名稱、類型及來(lái)源

1.2 器材與試劑

器材：光學(xué)顯微鏡、真空抽氣機(jī)、恒溫箱、蠟片切片機(jī)、相機(jī)、溫臺(tái)、展片臺(tái)、蠟杯、酒精燈、載玻片、蓋玻片、毛筆。

試劑：FAA固定液、乙醇溶液、醋酸、二甲苯、甲醛、伊紅、粘片劑、石蠟、染色液（固綠、番紅）、加拿大樹(shù)膠。

1.3 方法

于2019 年12 月10 日進(jìn)行冬季育苗，2020 年2月25 日定植于大棚，每份材料種植40 株，2020 年4月20 日在新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)中心試驗(yàn)大棚進(jìn)行采樣，并在此研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)。采樣前注意先將塑料袋和鑷子在液氮中預(yù)冷，用鑷子將大白菜花蕾粒輕輕采下放入采樣袋中。根據(jù)試驗(yàn)田種植的材料，取配對(duì)的3 個(gè)不育源，3 個(gè)與其對(duì)應(yīng)的保持系。在種植的植株上，完全隨機(jī)選擇花序，每個(gè)材料取頂部花蕾3～6個(gè)，取樣完畢后將樣品放入液氮罐中，于超低溫冰箱-80 ℃冷凍儲(chǔ)存。不育系類型的鑒定和細(xì)胞學(xué)觀察于河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用混合樣，無(wú)重復(fù)。

1.3.1 大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系類型的鑒定 在NCBI中檢索的細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的線粒體嵌合基因orf224（DQ400846.1）、orf138、orf222，利用生物學(xué)軟件primer5軟件設(shè)計(jì)出3對(duì)引物，由上海生物技術(shù)生物工程有限公司進(jìn)行合成。使用改進(jìn)的CTAB 方法分別提取6 個(gè)大白菜花蕾粒樣本花蕾DNA；并對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定其細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育類型。

1.3.2 大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的細(xì)胞學(xué)觀察 于2020 年5 月6 日9：00—10：00 采取長(zhǎng)度分別為（L≤1 mm、1 mm＜L≤2 mm、2 mm＜L≤3 mm，L 代表花蕾的長(zhǎng)度）新鮮大白菜花蕾，此時(shí)植物細(xì)胞分裂活動(dòng)明顯，取材效果最好。為了維持大白菜細(xì)胞的自然狀態(tài)，使形態(tài)和結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，取材后參照段國(guó)祿等的固定方法馬上進(jìn)行固定，參考何艷艷、張寶華的方法制作石蠟切片。在光學(xué)顯微鏡（XSP-8C，上海精密儀器儀表有限公司）下觀察切片，并進(jìn)行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

從NCBI 獲得線粒體嵌合基因orf138、orf224、orf222的序列，并通過(guò)Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物（表2）。

表2 設(shè)計(jì)引物的名稱及序列

2.2 CMS類型的鑒定

用設(shè)計(jì)的orf138 引物、orf224 引物和orf222 引物對(duì)3 個(gè)大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的6份花蕾粒DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖1 所示，orf138引物擴(kuò)增出的條帶2 清晰可見(jiàn)，即Ⅲ（紫不育系）為Ogura 型雄性不育系類型，ⅢB 為紫保持系；orf224引物擴(kuò)增出的條帶4和條帶6很清晰，即Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）為Polima型雄性不育系類型；條帶5（ⅡB）、條帶7（ⅠB）分別為苔保持系、晉毛保持系。orf222引物未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）、Ⅲ（紫不育系）都不屬于nap 型雄性不育系類型；orf224、orf138 和orf222 對(duì)保持系材料擴(kuò)增條帶均不清晰，即基因序列中沒(méi)有與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的開(kāi)放閱讀框序列。試驗(yàn)結(jié)果表明：Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）為Polima 型雄性不育系類型，Ⅲ（紫不育系）為Ogura 型雄性不育系類型；Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）、Ⅲ（紫不育系）都不屬于nap型雄性不育系類型。

圖1 orf224、orf138、orf222 引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 保持系材料和不育系材料花藥發(fā)育的特點(diǎn)

大白菜正常的花藥由4 個(gè)藥室組成，藥室由外到內(nèi)分別是表皮、纖維層、中層、絨氈層。絨氈層呈長(zhǎng)方形規(guī)則緊密地排列在藥室最里層，主要為花粉母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，隨著花粉發(fā)育會(huì)逐漸降解，花藥同一側(cè)2 個(gè)相鄰小孢子囊之間的組織也會(huì)逐漸消失，打通變成1個(gè)藥室。通過(guò)切片觀察，可以看到保持系材料IB 晉毛保持系、IIB 苔保持系和IIIB 紫保持系的花藥在各個(gè)時(shí)期都發(fā)育正常（圖2～4）。

大白菜CMS不育主要是雄蕊發(fā)育不正常，不能產(chǎn)生可育的花粉。通過(guò)切片觀察可以看到，不育系材料中大多在花蕾長(zhǎng)度≤1 mm 時(shí)就可以明顯看到差異，而后期本該形成藥室的地方只存在大量薄壁細(xì)胞。個(gè)別藥室可以形成花粉囊產(chǎn)生花粉，但在后期因花粉延遲發(fā)育或粘連在一起無(wú)法正常散粉。此外，還出現(xiàn)個(gè)別花藥有多藥隔、無(wú)藥隔情況（圖2～4）。

2.4 保持系材料和不育系材料花藥發(fā)育的區(qū)別

根據(jù)對(duì)保持系材料與不育材料花藥切片的細(xì)胞學(xué)觀察，在花蕾長(zhǎng)度小于等于1 mm時(shí)，保持系材料IB 晉毛保持系（圖2-2）、IIB 苔保持系（圖3-2）、IIIB紫保持系（圖4-2）在花蕾的橫切面上，可見(jiàn)1個(gè)雌蕊和4個(gè)雄蕊，花藥呈蝶形，4個(gè)藥室已經(jīng)形成，可以看見(jiàn)絨粘層在花粉囊內(nèi)染色較深，且維管束和花粉囊內(nèi)細(xì)胞均被染色。而I晉毛不育系（圖2-1）和II苔不育系（圖3-1）的4個(gè)花粉室尚未形成，III紫不育系（圖4-1）可以看見(jiàn)有花粉囊的形成，但染色較淺，沒(méi)有產(chǎn)生明顯的花藥。

圖2 I 晉毛不育系和IB 晉毛保持系細(xì)胞學(xué)觀察

圖3 II 苔不育系和IIB 苔保持系細(xì)胞學(xué)觀察

當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為1 mm ＜L≤2 mm 時(shí)，保持系材料花藥中藥室、藥隔更加清晰，絨粘層整齊的排列在小孢子囊母細(xì)胞的周圍，可以看見(jiàn)清楚的藥室由外到內(nèi)分別為表皮、藥室的內(nèi)壁、中層、絨氈層（圖2-4，3-4，4-4）。但不育系I 晉毛不育系（圖2-3）和II苔不育系（圖3-3）在這個(gè)時(shí)期仍然沒(méi)有形成花粉囊，III 紫不育系雖然有花粉囊的形成，但花粉囊內(nèi)的花粉較少，個(gè)別花藥內(nèi)不能正常形成4個(gè)藥室，還有個(gè)別花粉囊內(nèi)絨氈層膨大而擠壓小孢子形成一條縫隙，造成小孢子發(fā)育不良，呈現(xiàn)敗育的現(xiàn)象（圖4-3）。當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為2 mm＜L≤3 mm 時(shí)，保持系材料孢間層逐漸溶解，細(xì)胞逐漸分開(kāi)，變成圓球形，個(gè)別細(xì)胞呈四邊體形，著色較深（圖2-6，3-6，4-6）。不育系材料I 晉毛不育系雌蕊發(fā)育正常，從此時(shí)雌蕊發(fā)育的程度以及IB晉毛保持系的發(fā)育程度來(lái)看，花粉發(fā)育應(yīng)該和它的保持系發(fā)育一樣，但此時(shí)I 晉毛不育系仍然沒(méi)有藥室形成，細(xì)胞呈半透明狀，是典型的無(wú)花粉囊（圖2-5）。II苔不育系發(fā)育較晚，只有角隅處可以形成2～3 個(gè)藥室，而且花蕾橫切面不能呈正常的蝶形（圖3-5）。而可以觀察到III紫不育系花粉囊內(nèi)的細(xì)胞染色較淺，花粉囊內(nèi)的花粉粘連無(wú)法形成單個(gè)的圓形花粉粒，個(gè)別出現(xiàn)無(wú)藥隔的現(xiàn)象（圖4-5）。

圖4 III 紫不育系和IIIB 紫保持系細(xì)胞學(xué)觀察

3 討論與結(jié)論

近20年來(lái)，在大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育性研究方面，已報(bào)道有Ogura CMS、Polima CMS 和nap CMS等多種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系類型。Polima CMS 是最有生產(chǎn)價(jià)值的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，不僅在大白菜CMS不育系的選育中被廣泛利用，而且在其他十字花科作物雄性不育系的選育中也被廣泛應(yīng)用。2005 年趙利民建立了一套大白菜新品種灰色關(guān)聯(lián)度多維綜合評(píng)判方法，為客觀、準(zhǔn)確地從眾多大白菜組合中篩選出優(yōu)良新品種提供了科學(xué)依據(jù)，提高了新品種選育的準(zhǔn)確性和選擇效率。2018 年崔冰等對(duì)大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育形成的機(jī)制進(jìn)行研究。2020 年楊紅麗等培育出耐熱抗根腫病蘿卜胞質(zhì)雄性不育多基因聚合新品種。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，準(zhǔn)確快速鑒定樣本所歸屬的雄性不育系的類型，以便為開(kāi)展細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并為實(shí)現(xiàn)大白菜優(yōu)勢(shì)雜交育種提供分子依據(jù)。筆者對(duì)6 個(gè)大白菜材料CMS 的不育類型進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中Ⅰ晉毛不育系、Ⅱ苔不育系為Polima 型雄性不育系類型；Ⅲ紫不育系為Ogura 型雄性不育系類型；因其基因序列中沒(méi)有與本試驗(yàn)CMS 不育相關(guān)的開(kāi)放閱讀框序列，所以orf224、orf138和orf222引物均未擴(kuò)增出清晰條帶。

通過(guò)石蠟切片法進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)中大白菜保持系花藥均發(fā)育正常，可以形成4 個(gè)蝶形藥室從而產(chǎn)生可育的花粉。I晉毛不育系與可育材料IB晉毛保持系比較，I 晉毛不育系的敗育花藥一直處于孢原細(xì)胞之前，在整個(gè)時(shí)期內(nèi)都沒(méi)有形成花粉囊，屬于典型的無(wú)花粉囊型敗育，它的藥室異常出現(xiàn)較早，當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為L(zhǎng)≤1 mm時(shí)差異顯著；II苔不育系藥室異常出現(xiàn)較晚，在花蕾長(zhǎng)度為1～2 mm 時(shí)還未形成花粉囊，發(fā)育較晚，在花蕾長(zhǎng)度為2～3 mm時(shí)只有2～3個(gè)花粉囊可以形成，且花藥畸形，無(wú)法形成正常的蝶形藥室，個(gè)別花藥內(nèi)還出現(xiàn)多藥隔現(xiàn)象；III 紫不育系，在后期可以明顯地觀察到不育系花粉囊內(nèi)的花粉因相互粘連無(wú)法形成單個(gè)的花粉粒。2016 年郭瑛琪等大白菜核不育花藥敗育起始于減數(shù)分裂期絨氈層結(jié)構(gòu)異常，小孢子在四分體時(shí)期開(kāi)始敗育；不育發(fā)生后，伴隨著絨氈層細(xì)胞異常膨大，嚴(yán)重空泡化，提前降解，小孢子變形干癟而死亡。2012 年許明等研究表明不育花蕾長(zhǎng)度在2.5 mm后就已經(jīng)敗育，敗育時(shí)期可能發(fā)生在減數(shù)分裂后期到四分體時(shí)期。本試驗(yàn)與其研究結(jié)論一致，花蕾中花粉敗育的時(shí)期較早，當(dāng)L≤1 mm時(shí)，它就決定了花藥能否形成花粉囊從而產(chǎn)生花藥。