陳 蕊，李國(guó)生，王錦艷，胡鳳益

(1.云南省多年生稻工程技術(shù)研究中心/云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明 650500；2.保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南 保山 678000)

【研究意義】遺傳多樣性廣義上指地球生物圈所包含的遺傳信息集合，狹義上指同一個(gè)種的不同種群與同一個(gè)種群內(nèi)不同個(gè)體所產(chǎn)生的遺傳變異的總和，是種內(nèi)基因的變化，也稱基因多樣性[1]。對(duì)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析可以分離鑒定出有利的性狀或基因，為農(nóng)作物遺傳改良提供材料和基因。因此對(duì)種質(zhì)資源保護(hù)和精準(zhǔn)鑒定可以為農(nóng)作物遺傳改良提供有用的資源和基因?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻是中國(guó)主要糧食作物之一，全國(guó)超過60%的人口以大米作為主食[2]。1978—1982年，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源研究所牽頭開展的全國(guó)野生稻的全面考察與收集工作中，發(fā)現(xiàn)中國(guó)分布有普通野生稻、藥用野生稻及疣粒野生稻等3種野生稻，而這3種野生稻云南皆有分布[3]，明確了云南是中國(guó)地方稻種的基因多樣性中心和遺傳生態(tài)多樣性中心之一[4]。2005年黃燕紅等對(duì)中國(guó)栽培稻6個(gè)地理分布群的遺傳多樣性分析表明秈稻和粳稻的平均基因多樣性均以云南最為豐富,淮河上游次之,黃河以北最小[5]。保山市位于云南省西部，與緬甸接壤，總面積1.96萬 km2,其中山區(qū)、半山區(qū)面積約占92%，耕地面積3310 km2，分布在海拔535.0～3780.9 m，是云南省著名的“滇西糧倉(cāng)”。保山地處橫斷山脈滇西縱谷南端，高聳的高黎貢山和怒山山脈與深邃的怒江峽谷互相平行貫穿全境，地勢(shì)北高南低、高低懸殊大，形成“一山分四季，十里不同天”的氣候特點(diǎn)。豐富多元的氣候特點(diǎn)造就了該地區(qū)的生態(tài)多樣性和物種多樣性。【本研究切入點(diǎn)】稻作是保山主要糧食作物之一，栽培品種在20世紀(jì)50年代前以地方良種為主，到了60年代以外引品種為主，而70年代后以引育品種為主，并逐漸形成以保粳雜系列、隆科系列、云粳系列、岫系等為主的水稻品種(康洪燦，私人通訊)。70多年來保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所收集保存的1800多份稻種資源，成為云南乃至整個(gè)稻作遺傳改良的重要種質(zhì)庫(kù)和基因庫(kù)，編撰了《保山地區(qū)稻種資源志》(未發(fā)表)。但是，這些稻種資源的表型變異和遺傳基礎(chǔ)不清楚，限制了利用這些稻種資源的有利性狀和基因進(jìn)行稻作遺傳改良?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所保存的1800多份稻種資源中隨機(jī)選取96份材料，采用鑒別水稻真實(shí)性的48對(duì)SSR引物[6]進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)合該所1987年整理編寫的《保山地區(qū)稻種資源志》中記載的表型評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，分析保山稻種資源的生態(tài)、表型及遺傳多樣性。研究結(jié)果將有利于發(fā)掘保山稻種資源的有利性狀/基因，為科學(xué)有效地保護(hù)保山稻種資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從云南省保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所保存的1800多份稻種資源中隨機(jī)選取96份材料，包括農(nóng)家種38份，農(nóng)家種系統(tǒng)選育種6份，外引品種8份，其余44份材料無準(zhǔn)確記載而無法區(qū)分是農(nóng)家種還是改良種。96份材料中有52份材料在1987年保山農(nóng)科所存檔的《保山地區(qū)稻種資源志》中有表型評(píng)價(jià)記錄。用抽取的96份材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，有表型記錄的52份材料進(jìn)行表型多樣性分析。

1.2 種植地點(diǎn)

隨機(jī)抽取的96份材料于2020年在水稻生產(chǎn)同期種植于保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地。

1.3 表型評(píng)價(jià)

1.3.1 表型性狀 對(duì)有表型性狀記錄的52份稻種資源的秈粳性、粘糯性、成熟期、粒形、莖稈顏色、穎殼顏色、穎毛多少、有無芒、米色、抗病性共10個(gè)性狀進(jìn)行描述性考察。性狀進(jìn)行賦值標(biāo)準(zhǔn)化后，對(duì)其表現(xiàn)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 農(nóng)藝與產(chǎn)量性狀 對(duì)有表型性狀記錄的52份稻種資源的株高、產(chǎn)量、穗長(zhǎng)、穗粒、有效穗、空秕率、千粒重、生育期共8個(gè)農(nóng)藝性狀考察。分析每個(gè)性狀的最大值、最小值、均值和變異系數(shù)。同時(shí)，考察了這52份稻種資源2020年的株高。

1.4 基因型評(píng)價(jià)

隨機(jī)抽取的96份材料于田間取幼嫩葉片編號(hào)后置于密封袋中，采用CTAB方法[7]提取DNA。采用水稻品種DNA分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)(NY/T1433—2014)[6]的PCR擴(kuò)增體系和鑒別方法進(jìn)行遺傳多樣性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

考察的表型性狀數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等統(tǒng)計(jì)均用Excel 2016進(jìn)行處理；用平均數(shù)配對(duì)樣本T檢驗(yàn)方法對(duì)1987與2020年的株高差異進(jìn)行分析。

SSR引物的多態(tài)信息量(polymorphic information content, PIC)計(jì)算為PIC=1-Σfi2,fi表示第i個(gè)等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率[8]。用PowerMarker Ver 3.25統(tǒng)計(jì)群體總等位基因數(shù)(Number of alleles)、位點(diǎn)等位基因數(shù)(Number of alleles, Na)、等位基因頻率(Frequency of alleles)和多態(tài)信息含量(Polymorphic information content, PIC)等參數(shù)[9]。采用PowerMarker Ver 3.25 基于Nei’s(1983)計(jì)算遺傳距離的方法結(jié)合Fig Tree v1.4.3，用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)對(duì)96份稻種資源進(jìn)行聚類分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 保山稻種資源表型性狀變異分析

分析1987年《保山地區(qū)稻種資源志》有記錄的52份稻種資源的秈粳性、粘糯性、成熟期、粒形、莖稈顏色、穎殼顏色、穎毛多少、有無芒、米色、抗病性10個(gè)性狀發(fā)現(xiàn)：這些稻種資源分為秈粳2個(gè)亞種，秈稻為主的占86.54%，粘稻類型為主的占92.31%，糯稻類型較少；中熟和遲熟資源比例相當(dāng)，分別占53.85%和40.38%，早熟資源較少，僅占5.77%；粒形以橢圓形和細(xì)長(zhǎng)形為主，分別占比40.38%和36.54%；莖稈顏色多達(dá)6種，以褐斑桿黃色為主，占46.15%；穎殼顏色多為穎尖無色，占71.15%；有穎毛的稻種資源占98.08%；多數(shù)為無芒品種，占82.69%；具有抗稻瘟病和中抗稻瘟病的資源分別占34.62%和42.31%(表1)。說明保山稻種資源的表型性狀變異具有多樣性和豐富性。

表1 52份稻種資源的表型性狀

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 保山稻種資源的生態(tài)適應(yīng)性

1987年有記錄的52份稻種,有42份(80.8%)適應(yīng)在海拔1500～1700 m種植，個(gè)別稻種資源如擺郎谷(編號(hào)21)分布最為廣泛，在海拔1200～1800 m都能適應(yīng)生長(zhǎng)，而遲二芒(編號(hào)69)的種植海拔狹窄僅限于海拔1290 m左右種植。在52份稻種資源中，7份稻種資源(13.5%)分布在海拔1500 m以下地區(qū),且全部為秈稻，80.8%分布在海拔1500～1700 m，其中秈稻38份、粳稻4份，3份稻種資源種植海拔在1700 m以上，全部為粳稻。從分布區(qū)域來看，大紅谷(編號(hào)12、50、88、91)在保山轄區(qū)的2市3縣均有分布，是適應(yīng)性最廣泛的稻種資源(表2)。

表2 52份稻種資源種植海拔與種植地區(qū)記錄

續(xù)表2 Continued table 2

2.3 保山稻種資源農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀的變異

1987年有記錄的52份稻種資源的株高、產(chǎn)量、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、空秕率、千粒重、全生育期的變幅分別是119～171 cm、2625～6000 kg/hm2、18～32.6 cm、77～169 粒、33～155 粒、1.9%～72%、12.3～29.15 g、157～209 d，平均數(shù)分別是143.92 cm、4431.5 kg/hm2、24.49 cm、113.86 粒、98.13 粒、15.06%、24.7 g、175.75 d，變異系數(shù)分別是8.7%、21.8%、9.4%、17.3%、21%、85.2%、10.7%、7%(表3～4)。

52份稻種資源各性狀間的變異系數(shù)除株高(8.7%)、全生育期(7%)和穗長(zhǎng)(9.4%)較小外，其他性狀均較高，都在10%以上，其中產(chǎn)量變異系數(shù)為21.8%，穗粒數(shù)、單株有效實(shí)粒數(shù)與千粒重變異系數(shù)分別達(dá)到17.3%、21%與10.7%(表4)。研究表明，保山稻種資源的農(nóng)藝與產(chǎn)量性狀變異豐富多樣，可為稻作遺傳改良提供豐富的種質(zhì)資源。

表3 52份稻種資源農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀記錄

續(xù)表3 Continued table 3

表4 52份稻種資源農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀的變異分析

2.4 保山稻種資源株高的遺傳變異

對(duì)1987與2020年的株高(表3～4)進(jìn)行平均數(shù)配對(duì)樣本T檢驗(yàn)，結(jié)果表明1987年記錄的株高與2020年調(diào)查的株高之間差異不顯著(T=19.627,P<0.0001,df=51)，說明保山稻種資源的株高變異遺傳具有穩(wěn)定性。

2.5 保山稻種資源的遺傳多樣性

2.5.1 基于SSR分子標(biāo)記的分析 由表5可知，對(duì)96份稻種資源進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，48對(duì)推薦引物[6]中有35對(duì)引物具有多態(tài)性，遺傳多樣性高達(dá)73%。具有多態(tài)性的35對(duì)引物在96份稻種資源中共擴(kuò)增到100個(gè)多態(tài)性片段，根據(jù)國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T1433—2014)推薦的SSR引物分為4組，第I、II、III、IV組標(biāo)記各獲得26、24、26、24個(gè)多態(tài)片段，除RM176、RM561、RM567僅檢測(cè)到1個(gè)等位基因，其他32對(duì)引物均可檢測(cè)到2個(gè)及以上等位基因，等位基因變幅為1～6，平均每對(duì)引物可檢測(cè)到等位基因數(shù)為3.14；基因多樣性指數(shù)平均為0.33、變異范圍為0～0.71，多態(tài)信息含量(PIC)平均為0.3、變異范圍為0～0.66，而RM219、RM336、RM481、RM72、RM7102、RM3331、RM21、RM85、RM571、RM232等10對(duì)引物的PIC值均高于0.51，且等位基因數(shù)皆大于3。由此可見保山稻種資源具有較高的遺傳多樣性。

表5 96份稻種資源SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

2.5.2 聚類分析 基于NJ聚類分析表明在遺傳距離為0.4693時(shí)可將96份稻種資源劃分為2大類群(圖1)：第I類包含芒棒鳥嘴紅(編號(hào)90)、大紅谷(編號(hào)91)、硬冬谷(編號(hào)92)、拳頭白(編號(hào)80)、福光(編號(hào)74)、紅糯(編號(hào)64)、馬背皮紅(編號(hào)65)、劍川大白(編號(hào)59)、晚粳稻(編號(hào)58)、大白谷(編號(hào)57)、云香糯(編號(hào)60)11份稻種資源，僅大白谷、紅糯、芒棒鳥嘴紅、大紅谷、硬冬谷、拳頭白有表型評(píng)價(jià)記錄均為秈型、無芒；第II類包含其余85份稻種資源。第II大類群中，A類遺傳距離0.4456時(shí)聚到一起，是分布在1500～1800 m的大紅谷(編號(hào)88)和長(zhǎng)毛谷(編號(hào)53);B類包含王仁早(編號(hào)61)、埂子谷(63)、花祿豐(編號(hào)66)、軟紅(編號(hào)67)、紅銀丹(編號(hào)68)、遲二芒(編號(hào)69)、金果銀(編號(hào)70)、灰玉5號(hào)(編號(hào)71)、紅板所(編號(hào)72)、軟紅(73)、隴川谷(編號(hào)75)、大白谷(編號(hào)76)、花谷紅(編號(hào)77)、銀丹紅(編號(hào)79)、巴啟(編號(hào)81)、國(guó)川白(編號(hào)82)、紫稈紅(編號(hào)83)、冬糯(編號(hào)84)，這18份稻種資源遺傳距離0.455時(shí)聚到一起，其中有表型評(píng)價(jià)記載的有10份，2份為粳稻、8份為秈稻；C類包含其余的65份稻種資源。由此可以看出，保山現(xiàn)存的96份稻種資源的遺傳多樣性豐富。

在抽取的96份稻種資源中，記錄為相同名稱的云丹紅(編號(hào)3、8、24)在遺傳距離0.3554時(shí)分為2類(圖1)，大紅谷(編號(hào)12、50、88、91)在遺傳距離0.4693時(shí)分為2類，細(xì)祿豐(編號(hào)20、26、78)在遺傳距離0.428時(shí)分為2類，烏嘴麻線谷9(編號(hào)16、22)遺傳距離為0.3663時(shí)分為2類，紅糯(編號(hào)45、64)遺傳距離0.4693時(shí)被劃分為2類，長(zhǎng)毛谷(編號(hào)28、55)遺傳距離為0.4085時(shí)被劃分為2類，軟紅(編號(hào)67、73)遺傳距離0.4384時(shí)分為2類，以上7個(gè)在1987年的《保山地區(qū)稻種資源志》中記錄為相同名稱的稻種資源相對(duì)遺傳距離較大；可見保山現(xiàn)存稻種資源在保存的過程中存在同名異種現(xiàn)象。而遺傳距離最小的是麻線谷又叫龍大谷(編號(hào)14)和葉里藏(編號(hào)15)，遺傳距離為0.0648；其次是灰谷(編號(hào)35)和FN114(編號(hào)36)遺傳距離為0.1345，可見保山現(xiàn)存稻種資源在保存的過程中可能存在同種異名現(xiàn)象。

紅色表示I大類，藍(lán)色表示II大類里的A類，粉色表示II大類里的B類The red lines represent group I. The blue lines represent subgroup A of group II. The pink lines represent subgroup B of group II圖1 96份稻種資源的NJ聚類Fig.1 NJ clustering of 96 rice germplasms

3 討 論

稻種資源的遺傳多樣性是自然進(jìn)化的結(jié)果，在與自然環(huán)境相互作用的過程中稻種遺傳特性不斷加強(qiáng)，一些優(yōu)異的性狀得以保存并與環(huán)境協(xié)同進(jìn)化，而一些性狀卻也不斷丟失，導(dǎo)致遺傳多樣性下降。云南保山復(fù)雜的地理氣候條件形成了不同的稻種資源利用模式，豐富的民族文化習(xí)俗在一定程度上也影響著農(nóng)民對(duì)稻種資源的利用，例如對(duì)糯米的偏好選擇導(dǎo)致糯稻資源得以保存，這在一定程度上造就了保山稻種資源具有豐富遺傳多樣性的特點(diǎn)。從保山農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所保存的1800多份稻種資源中隨機(jī)抽取的96份分析結(jié)果看出保山的稻種資源具有豐富的表型多樣性、遺傳多樣性和生態(tài)適應(yīng)性，為稻作遺傳改良提供了豐富且重要的基因庫(kù)，為有效進(jìn)行作物種質(zhì)資源的收集、保存和利用提供了理論依據(jù)[11]。

3.1 稻種資源保護(hù)現(xiàn)狀

保山市農(nóng)業(yè)科技部門于20世紀(jì)50、60年代先后對(duì)稻種資源進(jìn)行收集整理，1979年進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的收集，共收集到489個(gè)品種資源，并對(duì)這些品種資源進(jìn)行了初步的整理編目，但其中有許多同名異種、同種異名的品種未進(jìn)行分類歸并，1985年云南省農(nóng)科院對(duì)該地區(qū)稻種資源品種進(jìn)行種植鑒定，對(duì)品種的來源、類型、表型性狀進(jìn)行考察，完成該地區(qū)稻種資源品種資料的編寫(未發(fā)表)，到1987年，共收集保存了1800多份稻種資源。通過研究發(fā)現(xiàn)在已收集的稻種資源中，盡管前人已有關(guān)于該地區(qū)稻種資源的記錄整理，但存在數(shù)據(jù)缺失嚴(yán)重，同名異種和同種異名現(xiàn)象較多，使得諸如株高、生育期、分蘗期、產(chǎn)量等重要形狀不清楚，品質(zhì)分析不足等問題。這些缺失都為該地區(qū)稻種資源的鑒定體系與評(píng)價(jià)保護(hù)造成困擾，亟待補(bǔ)充與完善。

3.2 保護(hù)及開發(fā)建議

隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的進(jìn)步，從基因組水平全面分析鑒定該地區(qū)稻種資源的遺傳多樣性、發(fā)掘產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要基因、并解析其分子機(jī)制已成為可能。

因此，有必要基于保山1800多份稻種資源30多年前歷史記錄信息，結(jié)合精準(zhǔn)的表型評(píng)價(jià)與分子生物學(xué)技術(shù)，深入評(píng)價(jià)其遺傳多樣性，建立保山稻種資源保護(hù)體系，挖掘資源中蘊(yùn)含的優(yōu)異基因，結(jié)合生產(chǎn)需要?jiǎng)?chuàng)制生產(chǎn)亟需的新種質(zhì)。為選育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、性狀優(yōu)良、品質(zhì)突出的稻作品種提供有力支撐[12]。

4 結(jié) 論

從保山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所保存的1800多份稻種資源中隨機(jī)選取96份材料，用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1433—2014)公布的水稻品種DNA分子鑒定48對(duì)SSR引物進(jìn)行基因型評(píng)價(jià)，并結(jié)合該所33年前(1987年)記錄的表型評(píng)價(jià)結(jié)果分析其多樣性。結(jié)果表明保山市農(nóng)科所保存的稻種資源表型變異具有多樣性、遺傳變異豐富，是稻作遺傳改良的重要基因庫(kù)，有必要深入開發(fā)利用這些重要的稻種資源。