李紫曦，牟美睿，楊仁杰，劉海學(xué)

(1. 天津農(nóng)學(xué)院園林園藝學(xué)院，天津 300384；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；3. 天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384；4. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384)

【研究意義】石斛的來源和品種確定是用藥過程中的重要環(huán)節(jié)，明確鐵皮石斛來源對保證鐵皮石斛用藥準(zhǔn)確性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet Migo)屬蘭科多年生草本植物，因其含有多種生物堿、多糖、酮類等成分[1]具有控制糖尿病和抗腫瘤等功效，是一種藥用價(jià)值極高的傳統(tǒng)中藥材。鐵皮石斛繁殖能力較低，在自然條件下發(fā)芽率不足5%，野生資源較少，因而市售大部分為栽培品[2]，但藥用功效及質(zhì)量高低不一，《中國藥典》2015版[3]明確指出，不同來源的鐵皮石斛性質(zhì)及藥效具有較大差異，同時(shí)生長環(huán)境可以顯著改變鐵皮石斛體內(nèi)的代謝成分[4]，有研究表明不同的生長環(huán)境對鐵皮石斛的有效成分會產(chǎn)生影響，而野外環(huán)境則更利于積累有效性較高的次生代謝物[5-6]。【本研究切入點(diǎn)】本文基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)(GC-MS)對6份來自不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，同時(shí)結(jié)合主成分分析、偏最小二乘判別分析、聚類分析等多元統(tǒng)計(jì)分析方法查找標(biāo)志性差異代謝物，構(gòu)建石斛代謝組學(xué)的產(chǎn)地鑒定方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為確定鐵皮石斛植源性鑒定的考量指標(biāo)提供參考，同時(shí)為鐵皮石斛質(zhì)量控制提供理論向?qū)Ш图夹g(shù)支持[7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測試中心保存的鐵皮石斛樣品，分別為來自貴州銅仁市沿河縣(11號)、廣東韶關(guān)仁化縣(21號)、浙江溫州雁蕩山鎮(zhèn)(31號)、云南普洱思茅鎮(zhèn)(41號)、湖南郴州資興市(51號)的野生石斛品種和來自湖南的室內(nèi)栽培石斛品種(61號)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 METTLER TOLEDO AL204電子天平；新芝SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)；Eppendorf Centrifuge 5920R冷凍離心機(jī)；凱航HH-2恒溫水浴鍋；睿科Reeko-Auto EVA全自動(dòng)氮吹濃縮儀；Aglient 7890A-5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；Aglient HP-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.2.2 藥品與試劑 乙腈、異丙醇、吡啶、正庚烷，純度均為色譜純；鹽酸甲氧胺、N-甲基N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.9%；超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制 參考張麗增等[8]方法，分別取6份試驗(yàn)材料長勢相同的鐵皮石斛成苗功能葉，液氮研磨至粉末，稱取150 mg加入體積比為1∶1∶1的乙腈—異丙醇—水混合溶液，超聲提取35 min(40 KHZ，4 ℃)后10 000 r/min離心1 min，取上清液100 μL氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.3.2 GC-MS分析條件 色譜條件：升溫程序?yàn)槌厣?100 ℃，色在 100 ℃下保持1 min，然后以10 ℃/min的速度升至280 ℃，保持 8 min，載氣為純度 99.999%的氦氣，流量為 1.0 mL/min進(jìn)樣模式不分流，進(jìn)樣量1 μL。離子源和進(jìn)樣口溫度分別保持在230和250 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲4.5 min；質(zhì)譜條件：EI能量-70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度-150 ℃；溶劑延遲4.5 min；掃描范圍-50～500 m/z；掃描速度2 scan/s。

1.3.3 衍生化處理 待有機(jī)試劑揮發(fā)盡后，進(jìn)行衍生化處理，取10 μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液(40 mg/mL)加入樣品中置于30 ℃恒溫90 min后，向樣品中加入30 μL衍生劑(MSTFA+1%TMCS)置于37 ℃恒溫30 min，最后加入1 mL溶劑正庚烷(含20 μg/mL內(nèi)標(biāo)物十一烷)過0.22 μm微膜，轉(zhuǎn)入GC進(jìn)樣瓶待上機(jī)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過GC-MS光譜全波段掃描石斛葉片代謝物質(zhì)，Agilent-MassHunter工作站對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取，最后得到保留時(shí)間(rt)及峰面積(intensity)，利用Origin 7.5繪制總離子流圖；導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Microsoft Excel 2016整理，并利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)進(jìn)行定性定量分析，通過SIMCA-P 13.0進(jìn)行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法—判別分析(PLS-DA)，使用 SPSS 23.0進(jìn)行t檢驗(yàn)(Student’st-test)，利用Omicshare平臺進(jìn)行聚類熱圖分析(HCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物GC-MS分析

對不同產(chǎn)地鐵皮石斛進(jìn)行GC-MS分析，通過總離子流圖(圖1)可以看出，6份石斛材料中共掃描出116個(gè)峰，出峰時(shí)間集中于12～20 min，但峰高及出峰時(shí)間存在品種間差異，經(jīng)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋后，6份石斛材料中共得到71個(gè)代謝物，如表1所示，包括20種有機(jī)酸、11種氨基酸、20種糖及衍生物和20種化合物。其中由于鐵皮石斛均屬蘭科植物，存在共有代謝物10種，如蘋果酸、天冬氨酸、半乳糖等。除此之外，不同產(chǎn)地的石斛代謝物之間存在明顯差異，其不同主要表現(xiàn)在糖類與有機(jī)酸上。糖類作為植物光合作用產(chǎn)生的單糖經(jīng)特定酶催化后形成的化合物[9]，可以看出由于環(huán)境的不同會造成石斛體內(nèi)代謝物的差異，因此可根據(jù)代謝物差異對石斛產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分。

圖1 不同產(chǎn)地鐵皮石斛GC-MS分析總離子流Fig.1 GC-MS analysis of total ion chromatogram of Dendrobium nobile from different productions

表1 不同產(chǎn)地鐵皮石斛GC-MS鑒定結(jié)果

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛差異代謝物鑒定

2.2.1 PCA分析 為清晰得出不同產(chǎn)地鐵皮石斛之間的代謝物差異，首先利用主成分分析(PCA)的方法對不同產(chǎn)地石斛代謝物進(jìn)行降維分析，得到二維與三維得分圖(圖2 a～b)進(jìn)而判別栽培品種鐵皮石斛與野生品種鐵皮石斛之間的差異。通過PCA分析可以得知，不同產(chǎn)地鐵皮石斛代謝物間存在顯著差異，第1主成分(t1)可以將栽培品種與貴州、廣東野生品種區(qū)分開，第2主成分(t2)可以將栽培品種與浙江、溫州野生品種區(qū)分開，但不能將湖南品種與栽培品種區(qū)分開，由于主成分分析僅能較好的反映原始數(shù)據(jù)，無法忽略組間差異，因此后續(xù)將采用有監(jiān)督的分析方法對湖南品種與栽培品種進(jìn)行區(qū)分。

圖2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛PCA二維(a)和三維得分圖(b)Fig.2 Two-dimensional (a) and three-dimensional scores (b) of PCA of Dendrobium from different products

2.2.2 PLS-DA分析 為進(jìn)一步鑒別野生石斛與栽培石斛之間的差異代謝物，對代謝物含量歸一化處理后進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)得到PLS-DA得分圖(圖3-a)，R2=0.984，Q2=0.997，同時(shí)為防止模型過擬合進(jìn)行交叉驗(yàn)證后所有點(diǎn)均小于原始R2，說明模型擬合較好且具有可行性。通過得分圖我們可以看出，有監(jiān)督的分析方法能較好的將湖南野生石斛品種與栽培品種區(qū)分開，進(jìn)而得出投影變量權(quán)重值(VIP)，圖中柱子高度與對模型貢獻(xiàn)值越高(圖3-b)，差異越顯著[10]。

圖3 不同產(chǎn)地鐵皮石斛PLS-DA得分圖(a)和VIP圖(b)Fig.3 PLS-DA score map of Dendrobium of different production lines (a) and VIP map (b)

2.2.3 差異代謝物鑒定 結(jié)合PLS-DA分析得出的VIP圖，再利用SPSS對篩選出的差異代謝物進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)合2種方法(VIP>1，P<0.05)篩選出兩地石斛的差異代謝物20種，分別為6種有機(jī)酸、6種糖類、3種氨基酸及5種化合物(圖4-a)，其中9種代謝物為湖南野生品種特有，包括3種有機(jī)酸(丁酸、丁烯酸、乙酰乙酸)、3種氨基酸(絲氨酸、甘氨酸、天冬酰胺)、2種糖及衍生物(葡糖醛糖、木糖)和1種化合物(芐醇)，而11種代謝物為室內(nèi)盆栽品種特有，包括3種有機(jī)酸(丙酸、十六烷酸、丁二酸)、4種糖及衍生物(阿拉伯糖、核糖、果糖、塔洛糖)、1種氨基酸(蘇氨酸)及3種化合物(二醇、抗壞血酸、苯丙醇胺)，對差異代謝物以差異倍數(shù)繪制火山圖(圖4-b)，20種差異代謝物分散在左右兩側(cè)，差異顯著。

圖4 湖南野生與室內(nèi)栽培鐵皮石斛差異代謝物(a)與差異代謝物火山圖(b)Fig.4 Different metabolites (a) and differential metabolites of Hunan wild and indoor cultivated Dendrobium candidum (b)

圖5 差異代謝物聚類分析熱圖Fig.5 Cluster analysis heatmap of differential metabolites

2.3 差異代謝物聚類熱圖分析

利用Omicshare 平臺根據(jù)差異代謝物鑒定篩選出的差異代謝物對不同產(chǎn)地鐵皮石斛進(jìn)行代謝物和品種兩個(gè)維度的聚類熱圖分析(HCA)，如圖5所示，樹形熱圖中橫坐標(biāo)代表不同產(chǎn)地鐵皮石斛品種，縱坐標(biāo)代表差異代謝物，其中紅色表達(dá)代謝物顯著上調(diào)，響應(yīng)藍(lán)色代表顯著下調(diào)，通過圖中我們可以看出，6號室內(nèi)栽培品種中蘇氨酸顯著上調(diào)，區(qū)別與其他品種，而丙酸顯著下調(diào)區(qū)別于其他品種，同時(shí)根據(jù)聚類熱圖分析可以看出，20種差異代謝物可以很好的將野生石斛品種與室內(nèi)栽培品種區(qū)分開。

3 討 論

鐵皮石斛含有多種化學(xué)成分，主要包括多糖、黃酮、生物堿、氨基酸等，也是鐵皮石斛發(fā)揮藥理活性的物基礎(chǔ)[11]。本試驗(yàn)基于氣質(zhì)聯(lián)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對6份不同產(chǎn)地的鐵皮石斛成苗代謝物進(jìn)行野生種于栽培種的差異分析，找到包括丙酸、蘇氨酸等在內(nèi)的20種顯著差異代謝物，大多為糖類(葡糖醛糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、果糖、塔洛糖)、酸類(丁酸、丁烯酸、乙酰乙酸、丙酸、十六烷酸、丁二酸)，其次為氨基酸類(蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸)和化合物類(芐醇、天冬酰胺、二醇、抗壞血酸、苯丙醇胺)。有研究表明，糖類、氨基酸和有機(jī)酸含量的增加能提高植物的抗逆性[12-13]。劉建兵[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，馬尾松苗木在干旱脅迫下，體內(nèi)脯氨酸及游離氨基酸含量顯著增加，同時(shí)高榮嶸等[15]在研究花生幼苗受到鹽脅迫后發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸的含量也表現(xiàn)出顯著上升，包雨卓[16]在分析冬小麥在低溫脅迫下的代謝物質(zhì)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分糖類、氨基酸和有機(jī)酸顯著增加，說明了冬小麥通過大部分糖類、氨基酸和有機(jī)酸的增加來抵御低溫的脅迫。多種植物在對生長環(huán)境適應(yīng)的過程中都表現(xiàn)出糖類、有機(jī)酸等物質(zhì)顯著增加的現(xiàn)象，而多糖也是鐵皮石斛花中的主要活性組分[17]，在本研究中通過對比野生石斛與室內(nèi)栽培石斛品種差異代謝物的種類與含量，反映野生種與栽培種石斛差異代謝物也主要體現(xiàn)在糖類、氨基酸及有機(jī)酸類，這可能是由于栽培品種石斛為了適應(yīng)生長環(huán)境從而使體內(nèi)代謝水平發(fā)生變化。

本研究以不同產(chǎn)地鐵皮石斛為材料進(jìn)行差異代謝物分析得出，野生品種石斛與栽培品種石斛在代謝物種類及含量水平上存在顯著差異，通過分析比較不同產(chǎn)地間鐵皮石斛小分子代謝物從而得出20種主要差異代謝物，從而達(dá)到鑒定不同產(chǎn)地鐵皮石斛的目的，為鐵皮石斛種質(zhì)鑒定研究提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

(1)經(jīng)GC-MS分析后，6份石斛材料中共得到71個(gè)代謝物，包括20種有機(jī)酸、11種氨基酸、20種糖及衍生物和20種化合物。其中存在共有代謝物10種，如蘋果酸、天冬氨酸、半乳糖等。

(2)經(jīng)PLS-DA分析后得出，主要差異代謝物分別為6種有機(jī)酸、6種糖類、3種氨基酸及5種化合物，其中9種代謝物為湖南野生品種特有，11種代謝物為室內(nèi)盆栽品種特有。

(3)對差異代謝物利用聚類分析，根據(jù)聚類熱圖分析可以看出，20種差異代謝物可以很好的將野生石斛品種與室內(nèi)栽培品種區(qū)分開，此方法具有可行性。