楊俊松，鐘穎穎，余 倩

（廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院, 廣東 廣州 510006）

相比于價(jià)格昂貴、提純困難、易失活變性的天然酶，近年來(lái)，高穩(wěn)定性、高催化活性、低成本的納米酶在食品、化工、環(huán)境、免疫分析、生物傳感等領(lǐng)域引起了人們廣泛的關(guān)注。特別是不需要使用H2O2的氧化酶樣納米酶越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用于生物傳感系統(tǒng)中以提高對(duì)分析物的檢測(cè)靈敏度。例如，Zhang等[1]將具有氧化酶模擬活性的磁性多孔氧化石墨烯應(yīng)用于高靈敏檢測(cè)細(xì)胞裂解物中的谷胱甘肽。Jin等[2]制備了具有氧化酶樣活性的PdPt雙金屬納米線(xiàn)用于酸性介質(zhì)中酸性磷酸酶的檢測(cè)。Hayat等[3]開(kāi)發(fā)了基于氧化酶樣活性的納米氧化鈰比色傳感策略用于高靈敏地檢測(cè)多巴胺和兒茶酚。IrO2作為一種貴金屬氧化物，因其獨(dú)特的性能在檢測(cè)、傳感、燃料電池及催化等各個(gè)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注[4-5]。例如，Quesada-González等[6]創(chuàng)建了基于IrO2NPs的電催化傳感系統(tǒng)用于快速、靈敏地檢測(cè)多溴聯(lián)苯醚。文獻(xiàn)[7-9]將IrO2NPs作為陽(yáng)極催化劑用于氧氣析出反應(yīng)中。此外，基于深藍(lán)色的IrO2NPs能與生物標(biāo)記物綴合，Quesada-González等[10]成功創(chuàng)建側(cè)向流動(dòng)生物傳感器用于靈敏地檢測(cè)人體免疫球蛋白。然而，IrO2的酶活性幾乎沒(méi)有被探索過(guò)，特別是將IrO2和MnO2原位整合形成復(fù)合納米酶還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

抗壞血酸(AA)是許多水果和蔬菜中天然存在的水溶性維生素，也是維持人類(lèi)健康的必需營(yíng)養(yǎng)素。攝取足夠的抗壞血酸對(duì)保持人體的健康至關(guān)重要，但AA不能在人體內(nèi)產(chǎn)生，只能從食品或藥品中獲得。長(zhǎng)期缺乏抗壞血酸，會(huì)導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)功能降低，并引發(fā)壞血病等疾病，但過(guò)量攝入也會(huì)對(duì)身體有害，例如會(huì)導(dǎo)致尿結(jié)石、胃痙攣等。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單、快速的方法分析食品和藥物制劑中AA的含量至關(guān)重要。通過(guò)納米酶催化反應(yīng)來(lái)測(cè)定AA越來(lái)越受到人們的青睞[11-16]。

因此，本文首先通過(guò)原位整合法制備IrO2@MnO2納米復(fù)合物。然后通過(guò)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)探究該復(fù)合物的氧化酶模擬催化能力，并與IrO2NPs和MnO2NPs進(jìn)行比較以驗(yàn)證IrO2@MnO2納米復(fù)合物具有協(xié)同提高的氧化酶模擬活性。接著優(yōu)化IrO2@MnO2納米復(fù)合物用于AA檢測(cè)的條件。最后在最優(yōu)檢測(cè)條件下，通過(guò)測(cè)定AA的檢測(cè)范圍和檢測(cè)限以探究IrO2@MnO2納米復(fù)合物用于AA檢測(cè)的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

檸檬酸鈉二元倍半水合物，六氯銥酸鉀(K2IrCl6)，五水合四甲基氫氧化銨(TMA·OH)，四水合氯化錳(MnCl2·4H2O)購(gòu)自阿拉丁(中國(guó)上海)?？箟难?AA)，3,3', 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，氫氧化鈉，硫酸，超純水，氧氣和其他試劑購(gòu)自麥克林(中國(guó)上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高速離心機(jī)(中科中佳，HC-2066，中國(guó))，酶標(biāo)儀(Infinite 200，Tecan，奧地利)。透射電子顯微鏡(TEM，HT7700，日本日立)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV2450，日本島津市)，Zeta電位分析儀(ZetasizerNanoZS，英國(guó)馬爾文)，X射線(xiàn)光電子能譜儀(XPS， Escalab 250Xi，美國(guó)賽默飛)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MnO2 NPs的制備

參考文獻(xiàn)[17]制備了MnO2NPs。具體如下：在室溫劇烈攪拌下將10 mL 0.3 mol/L的MnCl2·4H2O水溶液快速加入到20 mL由12 mL TMA·OH(0.6 mol/L)、2 mL H2O2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)和6 mL H2O組成的混合溶液中；所得混合溶液懸浮液繼續(xù)在室溫下劇烈攪拌12 h，以8 000 r/min離心20 min，所得沉淀用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌至中性，得到MnO2NPs。

2.2 IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的制備

參考文獻(xiàn)[10]制備了IrO2@MnO2復(fù)合納米酶。首先將制備所得的MnO2NPs分散于去離子水中配成質(zhì)量濃度(ρ)為125，62.5，31.3和15.6 μg/mL的MnO2NPs溶液；然后將50 mg檸檬酸二鈉鹽倍半水合物和30 mg K2IrCl6加入到上述不同質(zhì)量濃度的50 mL MnO2NPs溶液中，用0.25 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5；劇烈攪拌下將溶液加熱至沸騰，直至顏色變成藍(lán)灰色，保持溶液顏色繼續(xù)加熱30 min后室溫冷卻，檢查溶液pH是否維持在7.5，若不是，則調(diào)節(jié)溶液pH至7.5，接著重復(fù)煮沸30 min，直至pH穩(wěn)定在7.5；所得溶液在氧氣鼓泡下煮沸2 h，得到深灰色的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶溶液[10,17]。

用去離子水代替上述IrO2@MnO2復(fù)合納米酶制備方法中的MnO2NPs溶液制備得到IrO2NPs。

2.3 催化活性比較

通過(guò)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)探究了IrO2NPs、MnO2NPs和IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的催化活性，具體如下：往96孔板中加入150 μL不同濃度的TMB(208, 104, 52,26, 13, 6.5 μmol/L)，接著加入50 μL IrO2NPs、MnO2NPs或IrO2@MnO2復(fù)合納米酶，在37 ℃下反應(yīng)15 min后測(cè)定體系的吸光值(650 nm)，空白組不加TMB。根據(jù)朗伯比爾定律(式(1))可計(jì)算得到在總反應(yīng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生oxTMB的濃度c(μmol/L)。

式中：A為體系吸光度值，ε為吸光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)(oxTMB的摩爾吸光系數(shù)為3.9 ×104mol?1·cm?1·L)，c為吸光物質(zhì)濃度，b為吸收層厚度(實(shí)驗(yàn)所用比色皿厚度為1 cm)。將c除以總反應(yīng)時(shí)間得到單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生oxTMB的量v(μmol·L?1·min?1)。

最后根據(jù)式(2)以1/cTMB為橫坐標(biāo)，1/v為縱坐標(biāo)作雙倒數(shù)曲線(xiàn)，由曲線(xiàn)截距和斜率可計(jì)算得最大反應(yīng)速度Vmax和米氏常數(shù)Km[2,18]。

式中：V0為初始反應(yīng)速率，Cs為底物濃度。

2.4 抗壞血酸檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)AA準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)，本文優(yōu)化了IrO2@MnO2復(fù)合納米酶檢測(cè)AA的條件，包括體系pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和IrO2@MnO2復(fù)合納米酶濃度。具體步驟為：往96孔板中加入150 μL 416 μmol/L TMB和50 μL一定質(zhì)量濃度的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶(16.67，32，46.15，59.26，71.43，82.76，93.33 μg/mL)，在一定溫度下(25，31，37，43，49，55，61 ℃)反應(yīng)一定時(shí)間(5，10，15，20，25，30 min)后加入80 μL 2 mol/L H2SO4終止，最后在450 nm處測(cè)定體系吸光值。在此過(guò)程中，反應(yīng)體系的pH維持在一定數(shù)值(2，3，4，5，6，7，8，9或10)，另設(shè)置空白組(不加TMB)。最終將反應(yīng)體系最大吸光度值設(shè)為100%相對(duì)活性，以相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，體系pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間或IrO2@MnO2復(fù)合納米酶質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖。

2.5 抗壞血酸檢測(cè)范圍、定量限和檢測(cè)限測(cè)定

往96孔板中加入50 μL 71.43 μg/mL的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶和不同濃度的AA(0～1 250 μmol/L)，在37 ℃下反應(yīng)10 min后加入150 μL 416 μmol/L TMB，37 ℃下反應(yīng)5 min后加入80 μL 2 mol/L H2SO4，然后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定體系吸光值，反應(yīng)體系的pH為4，空白對(duì)照組不加TMB。最后，以AA濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性擬合。當(dāng)信噪比(S /N)為3時(shí)，檢測(cè)限(LOD)由式(3)得出。

當(dāng)信噪比(S / N)為10時(shí)，定量限(LOQ)由式(4)得出。

式中：SD代表空白組中多次測(cè)量的信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，m代表標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。

3 結(jié)果與分析

3.1 IrO2@MnO2復(fù)合物制備條件的優(yōu)化

為了獲得具有最優(yōu)氧化酶樣活性的IrO2@MnO2復(fù)合物，通過(guò)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)探究了其催化活性，結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1可得，當(dāng)MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL時(shí)所制備的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的Km最小(6.50 × 10?3mmol/L)，這表明其對(duì)底物TMB的親和力最高。因此選擇MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL制備IrO2@MnO2復(fù)合物。

表1 不同MnO2 NPs質(zhì)量濃度下制備的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的Km和Vmax比較Table1 Comparison of Km and Vmax of IrO2@MnO2 composite prepared under different MnO2 NPs concentrations

3.2 IrO2@MnO2復(fù)合納米酶表征

使用透射電鏡(TEM)、Zeta電位分析儀和X射線(xiàn)光電子能譜(XPS)對(duì)實(shí)驗(yàn)制備的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶進(jìn)行表征，通過(guò)ImageJ軟件對(duì)所得TEM圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到納米酶的平均粒徑。圖1(a)為MnO2NPs的TEM圖，結(jié)果顯示所制備的MnO2NPs為無(wú)規(guī)則納米顆粒。在不同MnO2NPs質(zhì)量濃度下制備的IrO2@MnO2復(fù)合物的TEM圖像如圖1(b～e)所示。可知，當(dāng)MnO2NPs質(zhì)量濃度為125，62.5，15.6 μg/mL時(shí)，可能由于MnO2NPs過(guò)量或不足，都不能很好地形成形態(tài)均一的IrO2@MnO2復(fù)合物。而當(dāng)MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL時(shí)能形成粒徑約為136 nm、形態(tài)均一的方塊狀I(lǐng)rO2@MnO2納米顆粒(圖1(c))，這表明MnO2NPs質(zhì)量濃度為31.3 μg/mL是制備IrO2@MnO2復(fù)合物的最佳濃度。

圖1 不同質(zhì)量濃度MnO2溶液制備的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶及IrO2@MnO2粒徑分布圖(ρMnO2=31.3 μg/mL)Fig.1 IrO2@MnO2 composite nanozyme prepared with different MnO2 solution concentration and partical size distribution of IrO2@MnO2(ρMnO2=31.3 μg/mL)

IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的XPS測(cè)試結(jié)果如圖2(a～c)所示：圖2(a)為XPS全譜圖，IrO2@MnO2復(fù)合納米酶中含有Ir、Mn和O元素。圖2(b)結(jié)果顯示Ir 4f在61.80 eV和64.83 eV處具有兩個(gè)峰，這可歸因于IrO2的Ir 4f5/2和Ir 4f7/2的結(jié)合能[19]。Mn 2p XPS窄譜(圖2(c))顯示在641.50 eV和653.20 eV處有兩個(gè)峰，這分別屬于Mn 2p3/2和Mn 2p1/2的結(jié)合能[20]。這些結(jié)果表明成功合成了IrO2@MnO2復(fù)合納米酶。圖2(d)為Zeta電位圖，結(jié)果顯示MnO2NPs和IrO2NPs的Zeta電位分別為?15.21 mV和?4.45 mV。而IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的Zeta電位為?16.38 mV，進(jìn)一步證明了IrO2@MnO2的成功合成。

圖2 IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的和XPS譜圖（a，b，c），IrO2 NPs, MnO2 NPs 和 IrO2@MnO2 復(fù)合納米酶的Zeta 電位（d）Fig.2 XPS spectra (a, b and c) of IrO2@MnO2 composite nanozyme, Zeta potentials (d) of IrO2 NPs, MnO2 NPs and IrO2@MnO2 composite nanozyme

3.3 IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的固有氧化酶樣活性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證IrO2@MnO2復(fù)合物的固有氧化酶樣活性，本文用酶標(biāo)儀測(cè)定了體系IrO2@MnO2+ TMB、IrO2@MnO2+ H2O、TMB + H2O在37 ℃下反應(yīng)15 min后的紫外吸收光譜。結(jié)果如圖3所示，只有IrO2@MnO2+TMB體系在650 nm附近有明顯的吸收峰，而對(duì)照組體系IrO2@MnO2+ H2O和TMB + H2O均無(wú)明顯吸收，這表明IrO2@MnO2復(fù)合納米酶具有固有的氧化酶樣活性。

圖3 IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的氧化酶樣活性Fig.3 Oxidase-like activity of IrO2@MnO2 composite nanozyme

3.4 IrO2 NPs、MnO2 NPs和IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的催化活性比較

為了驗(yàn)證經(jīng)過(guò)原位整合后能協(xié)同提高IrO2NPs和MnO2NPs的氧化酶樣活性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)探究了IrO2NPs、MnO2NPs和IrO2@MnO2復(fù)合物的催化活性，結(jié)果如表2所示，其中Km值越小代表催化劑對(duì)底物的親和力越大。從表2可得，經(jīng)過(guò)IrO2NPs和MnO2NPs原位整合形成的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶的Km(6.50 × 10?3mmol/L)顯著低于IrO2NPs(9.73 ×10?2mmol/L)和 MnO2NPs(2.41 × 10?1mmol/L)，這表明通過(guò)原位整合能協(xié)同提高IrO2NPs和MnO2NPs的氧化酶樣催化活性。

表2 IrO2@MnO2，IrO2 NPs和MnO2 NPs 的Km和Vmax比較Table2 Comparison of Km and Vmax of IrO2@MnO2, IrO2 NPs and MnO2 NPs

3.5 抗壞血酸(AA)檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)AA準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)，本文對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括體系pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間或IrO2@MnO2復(fù)合納米酶濃度，結(jié)果如圖4所示。從圖4(a)可得，IrO2@MnO2復(fù)合物的酶催化活性受pH的影響較大，在pH為4時(shí)達(dá)到最佳。圖4(b)顯示在不同的反應(yīng)溫度下，IrO2@MnO2復(fù)合物的酶催化活無(wú)明顯差異，這間接表明該復(fù)合物具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，最終選擇檢測(cè)溫度為37 ℃。從圖4(c)～(d)可得，當(dāng)IrO2@MnO2復(fù)合物濃度達(dá)到71.43 μg/mL，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5 min時(shí)，IrO2@MnO2復(fù)合物的酶催化活性即達(dá)到最大值，這表明5 min足夠讓所添加的IrO2@MnO2復(fù)合物充分氧化底物TMB，因此選擇5 min為最佳反應(yīng)時(shí)間，71.43 μg/mL為最佳復(fù)合物濃度。最終選定AA的檢測(cè)條件為：反應(yīng)體系pH為4、反應(yīng)溫度為37 ℃、反應(yīng)時(shí)間為5 min、IrO2@MnO2復(fù)合納米酶濃度為71.43 μg/mL。

圖4 AA檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.4 detection condition optimization results

3.6 抗壞血酸檢測(cè)范圍和檢測(cè)限的測(cè)定

在上述最優(yōu)檢測(cè)條件下，對(duì)AA的檢測(cè)范圍和檢測(cè)限進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出隨著AA濃度的增加，體系的吸光值逐漸下降，其中在AA濃度為0～312.5 μmol/L內(nèi)體現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性方程為y= ?0.002 01x+ 0.984 57(R2= 0.998 3)。另外經(jīng)計(jì)算得AA的定量限為14.2 μmol/L，檢測(cè)限為1.42 μmol/L，低于其他文獻(xiàn)所報(bào)道(見(jiàn)表3)，這表明該檢測(cè)方法對(duì)AA檢測(cè)具有高靈敏度。

表3 不同材料檢測(cè)AA檢測(cè)限比較Table3 Comparison of AA detection limits of different materials

圖5 AA的劑量響應(yīng)曲線(xiàn)Fig.5 Dose response curve of AA

3.7 方法精確度和穩(wěn)定性的測(cè)量

為了研究該檢測(cè)方法對(duì)于AA檢測(cè)在實(shí)際樣品中的應(yīng)用，首先將22.50 mgAA配置成10 mL水溶液，接著取10 μL 上述AA的濃溶液，加入到稀釋20倍的4種含AA的飲料中。然后往96孔板中加入50 μL 71.43 μg/mL的IrO2@MnO2復(fù)合納米酶，50 μL各組飲料稀釋液或加標(biāo)飲料稀釋液，37 ℃下反應(yīng)10 min后加入100 μL 416 μmol/L TMB，37 ℃下反應(yīng)5 min后加入80 μL 2 mol/L H2SO4。最后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定體系吸光值，結(jié)果如表4所示。從表4中可得在不同加標(biāo)濃度下，AA的加標(biāo)回收率為93.95%～103.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation， RSD，n=3)為2.87%～5.79%。此外，選取飲料1進(jìn)行了日內(nèi)和日間RSD的測(cè)定以考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在同一天內(nèi)對(duì)飲料1進(jìn)行3次加標(biāo)回收測(cè)量(AA的加標(biāo)量為23.72 μmol/L)所得的日內(nèi)RSD為3.14%，連續(xù)3天對(duì)飲料1進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)量(AA的加標(biāo)量為23.72 μmol/L)所得的日間RSD為3.27%。以上結(jié)果表明IrO2@MnO2復(fù)合納米酶用于食品中AA的檢測(cè)具有良好的精確度和穩(wěn)定性。

表4 從市售飲料樣品中測(cè)定AA的回收率Table4 4Determination of AA recovery rate from commercial beverage samples

4 結(jié)論

本文通過(guò)原位整合法制備了具有協(xié)同提高氧化酶樣活性的方塊狀I(lǐng)rO2@MnO2復(fù)合納米酶，并將其用于抗壞血酸的靈敏檢測(cè)，獲得了較寬的檢測(cè)范圍(0～312.5 μmol/L)和較低的檢測(cè)限(1.42 μmol/L)。因此其在食品監(jiān)測(cè)、生物醫(yī)藥、臨床診斷和免疫分析等領(lǐng)域具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。