王 凱，李鐘鳴，李巖松，劉先玲，丁胤彰，孫 燕，許 迪

單心室心臟病(single ventricle heart disease, SVHD)是一種由于胎兒時期心臟發(fā)育不全，只有一個功能性心室的先天性心臟病[1]。盡管當前內(nèi)科和外科治療都取得了長足的發(fā)展，但SVHD仍是嬰兒期心血管死亡的主要病因，也是小兒先天性心臟病人群發(fā)病的重要原因[2]。一項包括584例SVHD的臨床隨訪結(jié)果顯示，患者1歲時存活或不需心臟移植的發(fā)生率僅68.7%[3]。SVHD易引起充血性心力衰竭，約50%合并心力衰竭的SVHD患者在出生后1個月內(nèi)死亡，74%合并心力衰竭的SVHD患者在出生后6個月內(nèi)死亡[4]。因此，了解SVHD的發(fā)病機制，尋找其潛在的治療靶點具有重要意義。MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼、高度保守的RNA分子，可降解mRNA或與其靶基因的3′非編碼區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)目的基因的表達[5-6]。近來研究表明，miRNA與SVHD的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[4,7]。然而，目前SVHD的發(fā)病機制仍然不明，并且有很多miRNA還未被發(fā)現(xiàn)。本研究通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫篩選出SVHD差異表達的miRNA，并對其進行靶基因預測，從而構(gòu)建miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡，通過對靶基因進行GO及KEGG富集分析，以期尋找SVHD分子水平的發(fā)病機制及新的可能的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 基因芯片信息通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得基于GPL25134平臺的GSE136547的芯片數(shù)據(jù)。GSE136547數(shù)據(jù)集包括48例SVHD患者和32例健康人。

1.2 SVHD中差異表達miRNA的篩選48例SVHD患者和32例健康對照中差異表達miRNA通過R語言的limma程序確定。篩選條件：P<0.05，|log fold change>1|。使用R語言繪制差異表達miRNA的火山圖和熱圖。

1.3 miRNA靶基因預測通過miRWalk 3.0(http: //mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫對差異表達的miRNA進行靶基因預測，其中預測結(jié)點為3′UTR，預測評分0.95。選取miRDB、TargetScan以及miRTarBase三個數(shù)據(jù)庫的交集作為差異表達miRNA的靶基因。

1.4 miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建使用Cytoscape構(gòu)建miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡[8]。miRNA和靶基因作為結(jié)點，兩者之間的相互關(guān)系為連線。三角形代表miRNA，圓形代表靶基因。

1.5 miRNA靶基因GO和KEGG分析利用R語言的clusterprofiler對miRNA的靶基因進行GO生物學功能富集分析和KEGG信號通路富集分析[9]。GO生物學功能富集分析包括生物學過程(biological process, BP)、細胞組成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 miRNA靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(protein protein interaction network, PPI)分析及核心基因篩選通過string11.5(https: //www.string-db.org/)預測靶基因編碼的蛋白質(zhì)之間的關(guān)系并構(gòu)建PPI，PPI評分設置為0.4。使用Cytoscape軟件編輯PPI網(wǎng)絡，并且通過CytoHubba插件根據(jù)結(jié)點數(shù)篩選出前10個基因為關(guān)鍵基因[10]。

2 結(jié)果

2.1 SVHD中差異表達miRNA的篩選SVHD組和正常組共篩選出9個差異表達的miRNA，其中8個miRNA上調(diào)，1個miRNA下調(diào)(表1)。R語言的pheatmap繪制差異表達miRNA的聚類分析熱圖，R語言繪制差異表達miRNA的火山圖(圖1)。

圖1 A.SVHD中差異表達miRNA的火山圖；B.SVHD中差異miRNA的熱圖：紅色代表上調(diào)的miRNAs，綠色代表下調(diào)的miRNAs

表1 SVHD中差異表達的miRNA

2.2 miRNA靶基因的預測通過miRWalk 3.0預測差異表達miRNA的靶基因，取同時出現(xiàn)在miRDB、TargetScan以及miRTarBase三個數(shù)據(jù)庫中的基因為靶基因，共預測到129個靶基因(表2)。

表2 SVHD中差異表達miRNA的靶基因

2.3 miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡通過Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡。調(diào)控網(wǎng)絡中的miRNA包括hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-96-5p；靶基因主要有TP53INP1、ATXN1、NHLRC3、VMA21、ESR1、PDE4D(圖2)。

圖2 SVHD的miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡：三角形代表miRNAs；圓形代表靶基因

2.4 miRNA靶基因GO和KEGG分析GO富集分析包括CC、BP以及MF三個部分。GO富集分析在BP中主要為DNA損傷檢查點、對β淀粉樣蛋白的細胞反應、對β淀粉樣蛋白的反應、有絲分裂G1期DNA損傷檢查點以及G1期DNA損傷檢查點；在CC中主要有轉(zhuǎn)錄因子復合物以及RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復合物；在MF中主要有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性和特異性RNA聚合酶Ⅱ、磷蛋白結(jié)合、磷酸化酪氨酸結(jié)合殘基以及胰島素樣生長因子受體結(jié)合(圖3)。KEGG富集分析顯示靶基因主要富集在MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、人T細胞白血病病毒1感染、人類巨細胞病毒感染以及癌癥中的miRNA(圖4)。

圖3 SVHD中差異表達miRNA靶基因的GO富集分析：BP.生物學過程；CC.細胞組成；MF.分子功能

圖4 SVHD中差異表達miRNA靶基因的KEGG通路分析

2.5 miRNA靶基因的PPI分析及核心基因篩選去除不相關(guān)的蛋白節(jié)點后，進行靶基因的PPI構(gòu)建，PPI中共有67個節(jié)點，143條連線(圖5A)。通過CytoHubba插件根據(jù)結(jié)點數(shù)篩選出前10個關(guān)鍵基因，依次為MAPK1、CREB1、VEGFA、ESR1、SMAD2、IGF1R、IGF1、IRS1、APP、CRK(圖5B)。

圖5 A.SVHD中差異表達miRNA靶基因的PPI分析；B.篩選出的前10個關(guān)鍵基因

3 討論

SVHD是一種較為復雜及罕見的先天性心臟病，miRNA在SVHD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[7]。然而，SVHD發(fā)病的分子機制尚不明確，并且有很多與SVHD發(fā)病相關(guān)的miRNA尚未可知。因此，本組通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫，篩選出SVHD差異表達的miRNA，構(gòu)建miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡及PPI網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)了與SVHD發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵miRNA及其靶基因。

本研究選取了人的血液miRNA芯片，其中包括48例SVHD患者和32例健康人全血中的miRNA表達數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)通過比較兩組miRNA的表達水平，共篩選出9個差異表達的miRNA，其中有8個miRNA上調(diào)，1個miRNA下調(diào)；(2)miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡中miRNA包括hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-96-5p；(3)PPI中的關(guān)鍵基因為MAPK1、CREB1、VEGFA、ESR1、SMAD2、IGF1R、IGF1、IRS1、APP、CRK；(4)靶基因富集的通路主要是MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、人T細胞白血病病毒1感染、人類巨細胞病毒感染以及癌癥中的miRNA。

近年研究顯示miR-20a過表達可以改善擴張型心肌病的左室收縮功能，主要表現(xiàn)為改善左室射血分數(shù)[11]。此外，hsa-miR-20a-5p亦與左室重構(gòu)有關(guān)[12]。SVHD通常表現(xiàn)為左心室致密化不全，并伴有左室重構(gòu)的發(fā)生[13]。hsa-miR-20a-5p可能參與SVHD心室重構(gòu)的發(fā)展。SVHD的常見并發(fā)癥為心功能不全[14]，而心肌纖維化、氧化應激與心功能不全的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[15]。hsa-miR-18a-5p可通過Notch2通路抑制心臟纖維化[16]。hsa-miR-96-5p與氧化應激相關(guān)[17]。hsa-miR-18a-5p與hsa-miR-20a-5p可能分別通過纖維化途徑及氧化應激途徑參與SVHD導致的心功能不全的發(fā)生。SVHD的疾病進程伴隨心肌缺血、缺氧導致心肌細胞肥大，最終引起心功能不全，而hsa-miR-18a能夠抑制心肌細胞肥大[18]。本研究中hsa-miR-18a表達上調(diào)，過表達的hsa-miR-18a可能抑制SVHD引起的心肌細胞肥大。

SVHD會引起心室容量負荷過重，長期心室容量負荷過重可導致心功能低下。研究顯示，MAPK1是心肌收縮的關(guān)鍵因子，與心力衰竭發(fā)生相關(guān)[19-20]，故SVHD容量負荷過重可能首先引起MAPK1表達變化，MAPK1表達異常導致SVHD心力衰竭的發(fā)生。SVHD的常見病理生理為缺血缺氧，而缺血缺氧會引起心肌細胞增殖。CREB是一種細胞轉(zhuǎn)錄因子，可與cAMP反應元件的特定DNA序列結(jié)合以增加或減少靶基因的轉(zhuǎn)錄，并且增殖的心肌細胞中CREB1表達增加[21]。因此，CREB1可能參與SVHD發(fā)生、發(fā)展過程中的細胞增殖。2016年，Sandeep等[22]發(fā)現(xiàn)SVHD中VEGF的表達較正常人升高，表明VEGFA在疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。已有研究顯示ESR1、SMAD2、IGF1R、IGF1及IRS1與左心室重構(gòu)相關(guān)[23-26]，表明這些基因可能參與單心室心肌病的心室重構(gòu)。目前尚無研究顯示APP和CRK與SVHD或心室重構(gòu)的關(guān)系，它們可能是潛在的靶點，需要進一步研究來明確其相關(guān)性。

KEGG功能富集顯示靶基因主要富集在MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路。最近的研究顯示，抑制MAPK信號通路磷酸化可改善氧化應激[27]，而SVHD的發(fā)生過程中伴隨氧自由基的產(chǎn)生[28]。MAPK信號通路磷酸化激活氧化應激，從而導致SVHD的發(fā)生、發(fā)展。先前的研究表明MAPK信號通路及PI3K-Akt信號通路共同參與心室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展[29]。因此，MAPK與PI3K-Akt信號通路可能與SVHD的心室重構(gòu)相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SVHD中差異表達的miRNA及關(guān)鍵靶基因，并初步分析了其相關(guān)信號通路，后續(xù)將收集病例進一步分析，為SVHD的診治提供了新的研究思路及理論依據(jù)。