劉春方，劉文艷，滕瑞敏，楊 妮，劉潔霞，莊 靜*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，茶葉科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]作為一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。茶樹(shù)生長(zhǎng)在不同的環(huán)境條件下，光是影響茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一[1]。茶樹(shù)利用光吸收的能量來(lái)促進(jìn)光合作用，也通過(guò)監(jiān)測(cè)光的光譜組成、強(qiáng)度(光通量速率)、方向和時(shí)空模式來(lái)獲得關(guān)于周圍環(huán)境的信息。茶樹(shù)依靠這些信息對(duì)環(huán)境變化做出反應(yīng)，調(diào)控生長(zhǎng)和發(fā)育，以適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件[2]。光合能力是茶樹(shù)生長(zhǎng)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力，光合參數(shù)和葉片氣孔開(kāi)度一定程度上反映茶樹(shù)的光合能力。

晝夜節(jié)律被定義為在大約24 h的振蕩中發(fā)生的內(nèi)源性生物過(guò)程，也被稱為生物鐘[3]。生物鐘作為內(nèi)源計(jì)時(shí)分子網(wǎng)絡(luò)，可以測(cè)量環(huán)境中的每日和季節(jié)變化，并允許植物相應(yīng)地調(diào)整生理和發(fā)育過(guò)程[4]。晝夜節(jié)律受制于周期性的環(huán)境信號(hào)，并且可以通過(guò)各種刺激(如光信號(hào))來(lái)重置。因此，生物鐘整合了環(huán)境信號(hào)，并協(xié)調(diào)了植物整個(gè)生命周期中的發(fā)育事件[5]。

bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子的bHLH結(jié)構(gòu)域高度保守，由大約60個(gè)氨基酸組成，有兩個(gè)功能不同的區(qū)域，即堿性區(qū)域和HLH(helix-loop-helix)區(qū)域[6]。HLH結(jié)構(gòu)域的主要功能為促進(jìn)蛋白質(zhì)間相互作用，并且能形成同源二聚體和異源二聚體復(fù)合物[7]。bHLH的N端基本區(qū)域介導(dǎo)與特定六核苷酸序列的高親和力DNA結(jié)合，bHLH蛋白識(shí)別的核心DNA序列基序稱為E-box(5′-CANNTG-3′)，bHLH結(jié)構(gòu)域堿性區(qū)域的3個(gè)殘基是His/Lys-9、Glu-13和Arg-17，構(gòu)成了典型的G-box結(jié)合區(qū)[8]。bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中包括光信號(hào)傳導(dǎo)、果實(shí)和花發(fā)育以及氣孔發(fā)育等[9]。越來(lái)越多的bHLH蛋白在植物中的功能得到了鑒定，調(diào)節(jié)對(duì)環(huán)境的反應(yīng)是植物bHLH蛋白保留的一個(gè)原始功能，例如通過(guò)生物鐘的組成部分控制對(duì)光的反應(yīng)和相互作用[10]。

植物中的bHLH137最早在擬南芥中鑒定出來(lái)，隨后在水稻、大白菜、藍(lán)莓和番茄中鑒定到同源基因，如水稻OsbHLH80基因、大白菜BrabHLH139基因和藍(lán)莓VcbHLH004基因[6, 11-13]。在擬南芥中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以聚為12個(gè)亞組，AtbHLH137轉(zhuǎn)錄因子屬于Ⅻ亞組，劃分為32個(gè)亞家族，AtbHLH137轉(zhuǎn)錄因子屬于25亞家族，預(yù)測(cè)DNA結(jié)合基序包含G結(jié)合基序、E-box結(jié)合基序和G-box結(jié)合基序，該亞家族成員參與植物體內(nèi)油菜素甾體和脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控花瓣形態(tài)發(fā)生[10, 14-15]。AtbHLH137屬于DELLA蛋白應(yīng)答基因，DELLA蛋白是受光調(diào)控的生長(zhǎng)抑制因子，DELLA蛋白已被證明在植物體內(nèi)直接與光敏色素作用因子(phytochrome-interacting factors，PIFs)相互作用，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，在整合光和時(shí)鐘信號(hào)以驅(qū)動(dòng)日常生長(zhǎng)節(jié)律方面起著關(guān)鍵作用[16-18]。目前鑒定出茶樹(shù)bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子主要參與茶樹(shù)類黃酮合成和非生物脅迫。有研究篩選出7個(gè)bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因參與茶樹(shù)類黃酮生物合成途徑[19]。此外有研究提出了茶樹(shù)中與非生物脅迫相關(guān)的bHLH家族成員[9]。

茶樹(shù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控晝夜節(jié)律的表達(dá)情況和作用機(jī)理尚不清楚。本研究以茶樹(shù)‘蒙山9號(hào)’為材料，克隆獲得1個(gè)編碼CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子的基因，對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了序列比對(duì)、亞細(xì)胞定位、理化性質(zhì)、親水性和疏水性等方面的分析，并研究了其進(jìn)化樹(shù)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的茶樹(shù)葉片進(jìn)行氣孔開(kāi)度分析和光合參數(shù)測(cè)定，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因在晝夜節(jié)律中的響應(yīng)情況，旨在為進(jìn)一步研究茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)茶樹(shù)生物鐘的分子調(diào)控機(jī)制提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試材料為茶樹(shù)‘蒙山9號(hào)’[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze cv. Mengshan 9]兩年生扦插盆栽幼苗，種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)大棚。

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的‘蒙山9號(hào)’兩年生扦插幼苗，茶苗在12 h光照和12 h黑暗條件下(12:00-24:00光照)的光培箱預(yù)培養(yǎng)2 d，從中午12:00開(kāi)始取樣，之后24 h每隔2 h隨機(jī)選取健康植株，每株摘取一芽二葉初展葉片，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于實(shí)時(shí)定量的模板。隨機(jī)選取6株長(zhǎng)勢(shì)一致的健康植株測(cè)定葉片光合參數(shù)，每株重復(fù)測(cè)定5次。將不同時(shí)間點(diǎn)采集的茶樹(shù)葉片進(jìn)行氣孔切片制作。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 葉片氣孔切片分析采用指甲油印跡法測(cè)定葉片氣孔開(kāi)度[20]。每個(gè)處理隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3株茶苗，測(cè)定第2片葉的氣孔。先擦去葉片表面的灰塵，然后在葉片背面均勻涂抹指甲油，待指甲油自然晾干后，用透明膠帶黏貼葉片下表皮，粘取指甲油層，用手指抹平膠帶，使膠帶與指甲油之間充分接觸，無(wú)氣泡，撕取粘有指甲油層的膠帶，再貼至載玻片上，制成臨時(shí)玻片作為樣本，用Olympus光學(xué)顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)觀察氣孔，測(cè)量其長(zhǎng)度(縱徑，即啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度)與寬度(橫徑，即垂直于啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞的最寬值)，最后計(jì)算氣孔開(kāi)度，測(cè)定氣孔的面積用來(lái)表示氣孔開(kāi)度。氣孔開(kāi)度=π·ab，a=1/2氣孔長(zhǎng)度，b=1/2氣孔寬度。

1.2.2 葉片光合參數(shù)測(cè)定使用Li-6400便攜式光合儀(美國(guó)Li-COR公司)測(cè)定茶苗光合氣體交換參數(shù)。測(cè)定指標(biāo)包括葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)等。測(cè)定條件控制為光強(qiáng)600 μmol·m-2·s-1、CO2濃度400 μmol·mol-1、葉室溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度70%～80%。

1.2.3 總RNA提取和cDNA合成茶樹(shù)葉片總RNA的提取按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)(上海浦迪生物科技有限公司)進(jìn)行。RNA樣品濃度采用NanoDrop ND 1000(上海譜元儀器有限公司)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，RNA質(zhì)量用1.2%凝膠電泳檢測(cè)。參照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.4CsbHLH137基因的克隆基于茶樹(shù)基因組(http://tpdb.shengxin.ren/)數(shù)據(jù)[21]，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，上游引物CsbHLH137-QF序列為5′-ATGGCAACTTTTGCAAATTACCAACA-3′，下游引物CsbHLH137-QR序列為5′-TTATAAAATTGGGGTGTCCCAAAATG-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包含7 μL ddH2O、10 μL 2×PrimeSTAR Max Premix酶、1 μL cDNA模板和上下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性10 s；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物并將其回收，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性克隆菌液送至擎科生物公司測(cè)序。

1.2.5 基因表達(dá)量的測(cè)定參照Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)的操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)，CFX96TMreal-time PCR system作為熒光定量PCR平臺(tái)。采用相對(duì)定量的方法，以茶樹(shù)actin為內(nèi)參基因[22]。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[23]。

1.2.6 生物信息學(xué)分析在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)預(yù)測(cè)序列保守域，并用BLAST進(jìn)行序列同源性比較。利用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)和親/疏水性分析。登陸SMS(http://www.bio-soft.net/sms)和ExPASy(http://web.expasy.org/protparam)分析氨基酸序列組成及理化性質(zhì)。利用FoldIndex網(wǎng)站(https://fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex)分析氨基酸折疊無(wú)序化特性。蛋白亞細(xì)胞定位采用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/Cell-PLoc-2/)預(yù)測(cè)。擬南芥AtbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白全長(zhǎng)序列登陸TAIR(https://www.arabidopsis.org)下載，并利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[24]。采用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分別利用TMpred(https://embnet.vitalit.ch/software/TMPRED_form.html)和SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1)進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SOPMA在線網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行。登陸Swiss-Model(http://www.Swissmodel.expasy.org)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用PyMOL軟件生成三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。使用STRING網(wǎng)站(https://string-db.org)預(yù)測(cè)茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白的相互作用。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理對(duì)所測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Duncan’s多重比較法(P<0.05)，使用GraphPad Prism 8繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆

以茶樹(shù)葉片cDNA為模板，通過(guò)引物CsbHLH137-QF和CsbHLH137-QR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 000 bp左右的擴(kuò)增片段。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序與分析，結(jié)果表明茶樹(shù)CsbHLH137基因開(kāi)放閱讀框?yàn)? 023 bp，共編碼340個(gè)氨基酸。CsbHLH137基因序列登錄號(hào)為OL332046。

2.2 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)分析

為探究茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系，選取擬南芥(Arabidopsisthaliana)、獼猴桃(Actinidiadeliciosa)、蓖麻(Ricinuscommunis)等12個(gè)物種的bHLH137的氨基酸序列，與茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列構(gòu)建同源進(jìn)化樹(shù)(圖1)。圖1顯示，CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子與獼猴桃(A.deliciosa)、藍(lán)莓(V.corymbosum)等物種有較近的親緣關(guān)系，與毛果楊(P.trichocarpa)、野生大豆(G.soja)等物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子與其他植物相關(guān)氨基酸序列比對(duì)

茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子保守域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖2，A)顯示，bHLH_AtBPE_like保守結(jié)構(gòu)域位于該轉(zhuǎn)錄因子第165～249氨基酸位點(diǎn)之間，CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子的N端基本區(qū)域介導(dǎo)與特定六核苷酸序列的高親和力DNA結(jié)合，HLH區(qū)域形成同二聚體和異二聚體。將茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列與其他物種bHLH類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，茶樹(shù)與獼猴桃(A.deliciosa)、藍(lán)莓(V.corymbosum)、葡萄(V.vinifera)等物種的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子相似性為61.86%(圖2，B)。

2.4 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子氨基酸組成及理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站對(duì)茶樹(shù)、擬南芥和獼猴桃等13個(gè)物種bHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白的組成成分和理化性質(zhì)進(jìn)行分析[25]。由表1可知，bHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白相對(duì)分子量在31.77～40.63 kD之間，蛋白殘基數(shù)為286～364之間，理論等電點(diǎn)pI為5.59～8.75，茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白平均疏水性約為-0.728。不同植物中各氨基酸種類所占比例不同，其中堿性氨基酸所占比例普遍高于酸性氨基酸，脂肪族氨基酸高于芳香族氨基酸，總平均疏水性(Grand average of hydropathicity)均為負(fù)值，不同物種bHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白理化性質(zhì)相近且屬于親水性蛋白。利用NetPhos 2.0對(duì)CsbHLH137蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該多肽鏈0.5以上分值的氨基酸位點(diǎn)為20個(gè)，其中包含17個(gè)絲氨酸(S)和3個(gè)蘇氨酸(T)磷酸化位點(diǎn)。

2.5 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、氨基酸親疏水性及無(wú)序化結(jié)構(gòu)分析

利用Cell-PLoc 2.0對(duì)茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要定位于細(xì)胞核。由此推斷，茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白氨基酸序列的親水性和疏水性分析結(jié)果顯示，該轉(zhuǎn)錄因子疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第199位谷氨酰胺(Gln)，其次是第253位丙氨酸(Ala)；親水性最強(qiáng)的是第142位賴氨酸(Lys)，其次為第103位精氨酸(Arg)和第104位賴氨酸(Lys)；大部分氨基酸屬于親水性氨基酸?？偲骄杷詾樨?fù)值，表明CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白屬于親水性蛋白。利用FoldIndex對(duì)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行氨基酸序列折疊無(wú)序化分析，結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)錄因子存在4個(gè)氨基酸無(wú)序化區(qū)域，最長(zhǎng)無(wú)序區(qū)數(shù)目為116，共包含206個(gè)氨基酸，無(wú)序化比例為60.59%，無(wú)序化特征明顯(圖3)。

2.6 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析可知，CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子mean S-score的值小于0.5，表明CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白不存在信號(hào)肽序列，可能不屬于分泌蛋白。利用Tmpred在線網(wǎng)站進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白TM-螺旋長(zhǎng)度在17～33之間，不存在由內(nèi)至外螺旋和由外至內(nèi)螺旋，由此推測(cè)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子屬于非跨膜蛋白，沒(méi)有跨膜區(qū)域。

對(duì)茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，該轉(zhuǎn)錄因子的組成為α-螺旋有81個(gè)氨基酸，占比23.82%；延伸主鏈有39個(gè)氨基酸，占比11.47%；β-折疊有10個(gè)氨基酸，占比2.94%；隨機(jī)卷曲有210個(gè)氨基酸，占比61.76%。因此，CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成，α-螺旋、延伸主鏈和隨機(jī)卷曲貫穿于整個(gè)氨基酸鏈，β-折疊主要分布在氨基酸鏈的第170個(gè)氨基酸之后。采用Swiss-Model對(duì)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析，推測(cè)為同源二聚體，MITF/CLEAR box結(jié)構(gòu)。其HLH結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊(圖4)，該轉(zhuǎn)錄因子三級(jí)結(jié)構(gòu)以隨機(jī)卷曲和α-螺旋為主，推測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合。

2.7 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用STRING在線網(wǎng)站，通過(guò)比對(duì)，以擬南芥AtbHLH137轉(zhuǎn)錄因子為模板構(gòu)建了茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子與光敏色素E(phytochrome E，PYE)作用較為直接，與R2R3-MYB基因家族轉(zhuǎn)錄因子MYB60存在共同表達(dá)的關(guān)系，同時(shí)與MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB117、MYB105和MYB110關(guān)系密切。另外，二氫黃酮醇還原酶DFR與MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB60、MYB89、MYB105、MYB110和MYB117構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)可能在調(diào)節(jié)生物鐘介導(dǎo)的生理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(圖5)。

2.8 不同時(shí)間點(diǎn)茶樹(shù)葉片氣孔開(kāi)度及光合參數(shù)分析

不同時(shí)間點(diǎn)茶樹(shù)葉片的氣孔開(kāi)度不同(圖6)。與對(duì)照0 h相比，2 h和12 h顯著促進(jìn)葉片的氣孔開(kāi)度，分別高于對(duì)照34.99%和21.97%，4 h和18 h氣孔開(kāi)度顯著降低，分別低于對(duì)照16.7%和17.95%。施加光照的12 h中，氣孔開(kāi)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在2 h的氣孔開(kāi)度為光照處理下的最大氣孔開(kāi)度。黑暗處理的12 h中，氣孔開(kāi)度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在18 h的氣孔開(kāi)度為黑暗處理下的最小氣孔開(kāi)度。從表2可以看出，相較黑暗處理，光照處理對(duì)茶樹(shù)葉片氣孔開(kāi)度的影響在調(diào)節(jié)氣孔寬度方面更為明顯。凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)是反映植物葉片光合作用最主要的指標(biāo)。如圖7所示，茶樹(shù)葉片Pn、Gs和Tr均在4 h顯著下降達(dá)到最低值，分別為對(duì)照的0.06、0.11和0.13倍，Ci在2 h顯著下降達(dá)到最低，為對(duì)照的0.08倍。整體來(lái)看Gs、Ci和Tr在白天波動(dòng)較大，從0 h開(kāi)始顯著降低，出現(xiàn)最低值后顯著升高，之后在夜間維持較穩(wěn)定狀態(tài)，無(wú)顯著變化。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)茶樹(shù)葉片氣孔開(kāi)度的影響

2.9 茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因在茶樹(shù)的表達(dá)水平(圖8)。CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因在一個(gè)生物鐘周期中均有表達(dá)，在0、6和24 h的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間段。在光照12 h/黑暗12 h條件下24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因的動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果顯示，從0 h開(kāi)始施加光照該基因的表達(dá)量降低，4 h的基因表達(dá)量為對(duì)照的0.23倍，從4 h開(kāi)始表達(dá)量顯著升高，在6 h達(dá)到最高值，之后下降，到16 h時(shí)降到最低水平，16 h的基因表達(dá)量為對(duì)照的0.14倍；進(jìn)入黑夜后基本維持平穩(wěn)的低表達(dá)水平，后隨時(shí)間發(fā)生改變，在22 hCsbHLH137表達(dá)量顯著提高，24 h的基因表達(dá)量為對(duì)照的0.84倍。從不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)來(lái)看，在黑夜進(jìn)入白天的分界點(diǎn)0 hCsbHLH137表達(dá)量最高。結(jié)果表明CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因在白天表達(dá)量高，在光照后6 h出現(xiàn)一個(gè)峰值，之后呈下降趨勢(shì)，夜間表達(dá)量最低，整體表達(dá)呈節(jié)律性變化。

3 討 論

3.1 植物中的轉(zhuǎn)錄因子及與生物鐘調(diào)控

植物生物鐘振蕩器以大約24 h的固有周期運(yùn)行，植物生理節(jié)律如氣孔開(kāi)度控制和光合作用的一個(gè)主要來(lái)源是轉(zhuǎn)錄本積累的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)，它影響到大約40%的擬南芥基因[26-29]。轉(zhuǎn)錄因子家族的節(jié)律性表達(dá)廣泛地參與晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，如MYB、bHLH和bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族[30]。一直以來(lái)，晝夜節(jié)律機(jī)制相關(guān)的大多數(shù)分子成分在細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用[31-32]。另外轉(zhuǎn)錄因子與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)[33-35]。

3.2 CsbHLH137與赤霉素GA信號(hào)傳導(dǎo)

植物經(jīng)歷兩種不同的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，這取決于它們是在黑暗中生長(zhǎng)(暗形態(tài)建成)還是在光存在下生長(zhǎng)(光形態(tài)建成)，這兩條途徑之間的過(guò)渡受到嚴(yán)格監(jiān)管。來(lái)自擬南芥的研究表明，赤霉素GA是調(diào)節(jié)光形態(tài)發(fā)生的主要激素[36]。擬南芥AtbHLH137是GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因RGA的下游靶基因，參與GA介導(dǎo)的發(fā)育過(guò)程調(diào)控[37]。DELLA蛋白是GRAS轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的一個(gè)亞家族，通過(guò)負(fù)調(diào)控赤霉素信號(hào)來(lái)抑制GA介導(dǎo)的反應(yīng)[38]。AtbHLH137基因受到DELLA蛋白的強(qiáng)烈調(diào)控，DELLA蛋白誘導(dǎo)AtbHLH137轉(zhuǎn)錄因子作為GA信號(hào)的阻遏因子[17]。

3.3 CsbHLH137蛋白結(jié)構(gòu)與互作

茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子和其他多個(gè)物種進(jìn)行序列比對(duì)，均存在HLH結(jié)構(gòu)域，且一致性高達(dá)61.86%，說(shuō)明茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。采用Swiss-Model對(duì)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析，其HLH結(jié)合域推測(cè)為同源二聚體，MITF/CLEAR box結(jié)構(gòu)。在擬南芥中，AtbHLH137轉(zhuǎn)錄因子可以單獨(dú)或作為異源二聚體成為GA信號(hào)的阻遏因子，茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子因具有與其相似的結(jié)構(gòu)域可能行使相同的功能[37]。

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子與光敏色素作用較為直接，研究表明紅光受體的作用與生物鐘之間的直接聯(lián)系已經(jīng)建立[39]。一方面，光敏色素介導(dǎo)光信號(hào)向核心時(shí)鐘的傳遞機(jī)制已確立；另一方面，大多數(shù)光調(diào)控過(guò)程都是由時(shí)鐘調(diào)制的，這說(shuō)明了光和時(shí)鐘信號(hào)通路之間復(fù)雜的相互作用[40-43]。此外，研究表明植物晝夜節(jié)律的核心調(diào)控成分是主要由MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子組成[3]。CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子與MYB基因家族轉(zhuǎn)錄因子MYB60存在共同表達(dá)的關(guān)系，同時(shí)與其他MYB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系密切，表明CsbHLH137可能在生物鐘介導(dǎo)的各種過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3.4 CsbHLH137基因表達(dá)與生物鐘

本研究表明，茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因在白天的表達(dá)量高且出現(xiàn)峰值，在夜間維持平穩(wěn)的低表達(dá)水平，推測(cè)茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因受到DELLA蛋白的調(diào)控，DELLA蛋白誘導(dǎo)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子作為GA信號(hào)的阻遏因子調(diào)控光形態(tài)發(fā)生。研究表明DELLA蛋白的表達(dá)符合晝夜節(jié)律，其表達(dá)在白天達(dá)到高峰，在晚上表達(dá)水平較低[44]。DELLA蛋白受光控制，它的光調(diào)節(jié)為在一系列環(huán)境光條件下實(shí)施生長(zhǎng)抑制[37]。相對(duì)于夜間，DELLA蛋白在白天更穩(wěn)定，DELLA蛋白與GA受體蛋白的相互作用可以被核心時(shí)鐘蛋白GI抑制，GI可以在光照條件下結(jié)合和穩(wěn)定DELLA蛋白，調(diào)節(jié)DELLA蛋白的日節(jié)律積累模式[45-46]。通過(guò)對(duì)比茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因在晝夜節(jié)律中的表達(dá)特性，推測(cè)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)镈ELLA蛋白的應(yīng)答基因，在光照條件下DELLA蛋白表達(dá)水平高導(dǎo)致CsbHLH137表達(dá)上調(diào)并出現(xiàn)峰值，在黑暗條件下DELLA蛋白表達(dá)較低導(dǎo)致CsbHLH137夜間表達(dá)維持低水平狀態(tài)。相較黑暗處理，光照處理在調(diào)節(jié)茶樹(shù)葉片氣孔寬度方面更為明顯，光合參數(shù)Gs、Ci和Tr在白天波動(dòng)較大，夜間維持較穩(wěn)定狀態(tài)的結(jié)果與CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因節(jié)律性表達(dá)情況相符，一定程度上表明，CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因可能受到DELLA蛋白調(diào)控，參與光形態(tài)建成。

本研究克隆了CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因并分析了其生物鐘的表達(dá)情況，分析了茶樹(shù)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)円构?jié)律的響應(yīng)，初步推測(cè)CsbHLH137轉(zhuǎn)錄因子基因作為DELLA蛋白應(yīng)答基因參與茶樹(shù)的光形態(tài)建成，但其在茶樹(shù)中可能存在的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。