沙曉蓉，張 萍，王云霞，卜虎柏，馬 瑩，靳 磊

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750000)

釀酒葡萄是寧夏回族自治區(qū)的優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)，寧夏賀蘭山東麓作為中國葡萄酒“地理標(biāo)志產(chǎn)品產(chǎn)地”之一，因其獨特的氣候、土壤條件，被業(yè)內(nèi)公認為是世界釀酒葡萄栽培的“黃金”地帶[1]?！级帑悺?Chardonnay)是賀蘭山東麓主栽釀酒葡萄品種之一，其果實品質(zhì)受到溫度、光照、水分、海拔高度和土壤養(yǎng)分等環(huán)境因素的影響[2]。果實成熟度、糖、酸、香氣及多酚是評價釀酒葡萄果實品質(zhì)的主要指標(biāo)[3]，葡萄酒“七分原料，三分釀”，葡萄品質(zhì)是釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的根基。黃烷-3-醇作為果實中含量最豐富的多酚類物質(zhì)之一，是決定葡萄酒品質(zhì)的一個重要因子，對葡萄酒澀、苦味的優(yōu)劣和強弱，以及對葡萄酒的諸多感官品質(zhì)[4]，如色澤、風(fēng)味、澄清度、收斂性、褐變及貯藏壽命和穩(wěn)定性都具有決定性作用[5-6]。同時，黃烷-3-醇能夠被人體快速吸收，有一定的藥理學(xué)作用和保健功能，如抗氧化性和清除自由基的活性[7-8]，抑制動脈硬化和保護心血管[9-10]，皮膚保健美容等作用，是葡萄果實和葡萄酒中非常重要的功能性成分[11-13]。因此，研究釀酒葡萄中酚類物質(zhì)對葡萄酒的釀造具有指導(dǎo)意義。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對釀酒葡萄中酚類物質(zhì)的研究比較廣泛，但是對與葡萄酒苦澀感相關(guān)的黃烷-3-醇類單體的定性定量研究較少。葡萄的成熟條件不同，葡萄中酚類物質(zhì)的含量及類別也不相同，葡萄的適時采收將直接影響葡萄的質(zhì)量，進而影響葡萄酒的品質(zhì)，通過酚類物質(zhì)的研究則可以對葡萄成熟度做出更加準(zhǔn)確的判斷。前人[14-15]采用高效液相色譜法對葡萄果實中的黃烷-3-醇單體含量進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄果實含有兒茶素[(-)-catechin, CAT]、表兒茶素[(-)-epicatechin, EC]和表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate, ECG]3種單體。鄧波[16]以‘赤霞珠’和‘蛇龍珠’葡萄品質(zhì)為試材，研究不同品種葡萄部位中黃烷-3-醇類化合物單體CAT、EC、ECG含量的差異，結(jié)果表明不同品種葡萄部位中黃烷-3-醇類化合物單體的含量有明顯差異，‘赤霞珠’葡萄果皮和果梗中的CAT含量高于‘蛇龍珠’。李小龍[17]研究表明，在葡萄果實發(fā)育過程中，‘赤霞珠’種子內(nèi)酚類物質(zhì)總量總體呈下降趨勢，在幼果期其含量下降較為緩慢，果實成熟后期下降速率減緩并趨于穩(wěn)定。黃烷-3-醇類物質(zhì)是類黃酮代謝途徑的產(chǎn)物[18-19]，其生物合成是一個復(fù)雜的過程，由多個基因表達及相關(guān)酶綜合調(diào)控。秦晨亮[20]研究了赤霞珠果實不同發(fā)育階段果皮中酚類物質(zhì)與其相關(guān)酶活性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)赤霞珠葡萄果皮PAL活性在生長發(fā)育過程中呈雙峰型變化趨勢，分別在花后35和80 d達到高峰。CHI基因表達水平隨著果實的發(fā)育而逐漸下降[21]。但前人對于葡萄果實中黃烷-3-醇類單體的研究主要集中在干紅葡萄上，而對白葡萄的研究報道較少。特別是白葡萄中黃烷-3-醇生物合成和積累與其合成相關(guān)酶及相關(guān)基因表達的關(guān)系鮮見報道。因此，研究白葡萄品種果實中黃烷-3-醇單體及含量的變化規(guī)律，探討其生物合成途徑及相關(guān)酶活性變化、相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達，對于‘霞多麗’等白葡萄品種資源開發(fā)及利用具有重要意義。

本研究應(yīng)用HPLC技術(shù)，通過對白葡萄品種‘霞多麗’果實中酚類物質(zhì)的定性定量分析來探討其在漿果發(fā)育過程中的變化規(guī)律和合成相關(guān)酶活性變化，同時利用qRT-PCR技術(shù)對果實發(fā)育過程中黃烷-3-醇生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因進行定量分析，探討黃烷-3-醇含量變化與其生物合成相關(guān)酶及相關(guān)基因的關(guān)系，對闡明釀酒葡萄次生代謝產(chǎn)物生物合成過程具有重要意義，同時也為優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄品種的培育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

寧夏賀蘭山東麓地區(qū)白葡萄品種‘霞多麗’果實采自銀川市美御酒業(yè)有限公司葡萄種植基地。葡萄樹常規(guī)水肥管理，冬天埋土防寒，避免凍傷，用寬行密株的栽培方式，株行距為0.5 m×3.0 m，單壁籬架栽培，每隔10～15 cm留1個結(jié)果枝，每個結(jié)果枝留1穗果。選取長勢一致的‘霞多麗’葡萄優(yōu)良植株60株，花后20 d(2020年6月13日)開始采樣，每10 d采樣1次，共采樣8次。每次隨機選取3株，于植株東、西兩側(cè)分別采集果穗各1穗，共6穗。果穗采集后，去除機械傷害、病蟲害及發(fā)育異常果粒，裝入冰盒，迅速帶回實驗室用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Aglient 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Light Cycler 4801I型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)；Christ Alpha 1-4 LSC plus冷凍干燥機(德國Christ公司)；FRQ-1006單槽超聲波清洗機(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)；KH19A離心機(湖南凱達科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 葡萄果實中黃烷-3-醇單體含量測定

1.3.1 葡萄果實中黃烷-3-醇的提取將葡萄樣品用液氮研磨，冷凍干燥，干燥后的粉末于-40 ℃冰箱中保存待用。稱取葡萄果實干粉1.0 g置于15 mL離心管中，加入10 mL 70%甲醇(HPLC)，搖勻，遮光超聲45 min(80 Hz)后離心15 min(4 ℃)，取上清液經(jīng)0.25 mm濾膜過濾后上樣待檢。

1.3.2 黃烷-3-醇單體HPLC分析條件色譜柱采用Zorbax Eclipse SB-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm粒度色譜柱)；檢測波長為280 nm，柱溫40 ℃，進樣量10 μL，流速0.5 mL/min。梯度洗脫：流動相A為0.4%甲酸水溶液，流動相B為乙腈(HPLC)。洗脫程序：0～10 min，B 1%～10%；10～20 min，B 10%～20%；20～32 min，B 20%～35%；32～35 min，B 35%～100%；35～37 min，B 10%。

1.3.3 黃烷-3-醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將20 mg沒食子兒茶素(GC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、兒茶素(CAT)、表兒茶素(EC)標(biāo)品，加入2 mL 70%甲醇配成母液，將母液依次稀釋為100、50、25、10、5 mg/L的5個不同濃度梯度的溶液，把準(zhǔn)確配置的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液在上述色譜條件下分別進樣10 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)和結(jié)果見表1，所得液相圖譜見圖1。從表2可知，4種黃烷-3-醇單體的溶液濃度與峰面積相關(guān)系數(shù)均在0.994 3以上，說明相關(guān)性良好，可以滿足定量的需要。

表1 4種黃烷-3-醇的線性方程及相關(guān)系數(shù)

1.4 黃烷-3-醇生物合成相關(guān)酶活性的測定

苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參照何慕涵等[22]的方法，以U·g-1表示；查爾酮異構(gòu)酶(CHI)活性測定參照高婭北等[23]的方法，結(jié)果以U·g-1表示；黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫類黃酮還原酶(DFR)活性測定參考劉美玲等[24]的方法，結(jié)果以μg·g-1·h-1表示；類黃酮3′-羥化酶(F3′H)活性測定參考何鳳平等[25]的方法，結(jié)果以U·g-1表示；花色素苷合成酶(ANS)活性測定參考杜麗娟[26]的方法，結(jié)果以U·g-1表示。

1.5 黃烷-3-醇生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達分析

1.5.1 RNA提取葡萄果實總RNA的提取采用多糖多酚植物專用RNA提取試劑盒Quick RNAisolation Kit進行，具體步驟參見說明書。

1.5.2 cDNA的合成按照Reverse Transcription System Kit試劑盒說明，建立總體積為20 μL的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。首先在DEPC處理過的PCR管中加入總RNA 2 μL，再加入50 μmol/L Oligo(dT15)1.5 μL，變性10 min于70 ℃水浴中，立即冰浴2 min，離心，將液體收集于管底。依次加入4 μL 15xRT緩沖液、1 μL RNA酶抑制劑(Rnasin，20 μ/μL)、2 μL dNTPs(200 μmol/L)、1 μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶、8.5 μL DEPC處理水于冰浴中?；靹蚝箅x心，將液體收集于管底，42 ℃溫浴1 h，99 ℃加熱5 min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，立即冰浴5 min，-20 ℃保存。

1.5.3 PCR引物設(shè)計根據(jù)Gene Bank中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫類黃酮還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、類黃酮3′-羥化酶(F3′H)基因的全長序列，利用Primer 5.0設(shè)計PCR擴增引物(引物序列見表2)，經(jīng)北京擎科生物科技有限公司合成。選擇Actin基因作為內(nèi)參，對試驗結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表2 實時熒光定量 PCR 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)分析

每個測定指標(biāo)3次重復(fù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010，利用SPSS19.0軟件進行方差分析(ANOVA)，Duncan多重比較方法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)，目的基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算；用Pearson相關(guān)性分析法揭示葡萄漿果發(fā)育過程中黃烷-3-醇積累代謝與基因表達量的耦合關(guān)系；用Excel 2010軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘霞多麗’果實發(fā)育過程中黃烷-3-醇含量的變化

由表3可知，霞多麗葡萄果實在整個發(fā)育時期，黃烷-3-醇類化合物GC、ECG含量大部分時間遠高于CAT、EC含量。其中，GC含量隨著果實發(fā)育整體呈先升高后下降趨勢，在花后40 d(7月3)日出現(xiàn)峰值(40.02 mg/g)，并與其余時期存在顯著差異，花后90 d(8月22日)比峰值時顯著減少了91.85%；ECG的含量在果實發(fā)育初期未檢測到，在花后50 d(7月13)時出現(xiàn)最高值(47.69 mg/g)并與其他時期差異顯著，隨后含量持續(xù)下降，且至花后90 d(8月22日)出現(xiàn)最低值，最低值比最高值顯著降低了53.87%；CAT含量總體呈降-升-降的變化趨勢，也在花后50 d(7月13日)時出現(xiàn)最高峰(18.68 mg/g)，并與其他時期相比差異顯著；EC含量的變化總體呈先升后降趨勢，同樣在花后50 d(7月13日)達最大值(42.73 mg/g)，比花后40 d(7月3日)增加了2.19倍，其最低值出現(xiàn)在花后20 d(6月13日)，僅為2.69 mg/g。

表3 ‘霞多麗’果實發(fā)育過程中黃烷-3-醇類化合物的含量變化

2.2 ‘霞多麗’果實發(fā)育過程中黃烷-3-醇生物合成相關(guān)酶活性的變化

黃烷-3-醇生物合成相關(guān)酶PAL、F3H、F3′H、CHI、DFR和ANS活性測定結(jié)果(圖2)表明，PAL和ANS活性變化趨勢較為一致，均呈先升高后降低的變化趨勢，且在花后30 d(6月23)出現(xiàn)最大值，并與其他時期存在顯著差異；F3H、F3′H、CHI活性都在花后20 d(6月13)出現(xiàn)最大值，而后各酶活性迅速降低，說明花后20 d是‘霞多麗’酶促反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵時期；DFR活性先升高后降低，在花后50 d(7月13)再次升高，后隨果實成熟逐漸降低。另外，各種相關(guān)酶活性在8/2～8/22期間整體維持在偏低水平，且無顯著差異。

2.3 ‘霞多麗’果實發(fā)育過程中黃烷-3-醇生物合成相關(guān)基因的表達特征

‘霞多麗’葡萄果實中黃烷-3-醇生物合成相關(guān)基因的表達分析結(jié)果(圖3)顯示，在葡萄果實發(fā)育過程中，PAL、ANS基因的表達情況相似，均是在果實生長初期(6/13～6/23)上調(diào)，且表現(xiàn)為顯著上升趨勢，至花后30 d(6月23日)達到最高值，隨后表達水平大幅下降，總體呈下調(diào)趨勢并維持在較低水平；F3H、CHI基因表達均呈先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，隨著果實成熟表達逐漸加強，CHI基因相對表達量在花后90 d(8月22日)達到最大值，而F3H基因的相對表達量在果實生長初期(6月13)具有最大值，并遠高于其余時期；F3′H基因的表達水平在果實生長初期快速下調(diào)，而后隨果實成熟逐漸上調(diào)，但仍始終顯著低于生長初期的最大值(6月13日)；DFR基因的表達水平隨著果實生育期顯著先上調(diào)，而后大幅度顯著下調(diào)，隨果實成熟再次上調(diào)，但仍始終維持在較低水平。

2.4 ‘霞多麗’果實發(fā)育過程中黃烷-3-醇含量與生物合成相關(guān)酶活性和相關(guān)基因表達量的相關(guān)性

由表4可見，‘霞多麗’葡萄果實中黃烷-3-醇單體GC含量與CHI、DFR基因相對表達量為負相關(guān)，與F3H、F3′H基因表達為正相關(guān)； ECG含量與ANS、PAL基因表達為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)較小分別為0.252、0.338，與F3H、CHI、DFR、ANS、F3′H基因表達為負相關(guān)；CAT含量與F3H、F3′H基因表達為正相關(guān)。但是，以上相關(guān)關(guān)系均未達到顯著水平。

表4 黃烷-3-醇含量與合成相關(guān)酶活性及相關(guān)基因表達量的相關(guān)系數(shù)

同時，GC含量與生物合成相關(guān)酶活性均呈正相關(guān)關(guān)系，其中F3H、F3′H和ANS活性與GC含量為顯著正相關(guān)，說明F3H、F3′H和ANS活性的提高可能對GC含量的積累有顯著促進作用；EC含量與合成相關(guān)酶均為負相關(guān)關(guān)系，ECG含量與合成相關(guān)酶均為正相關(guān)關(guān)系，而CAT含量與DFR、ANS和PAL酶活性呈負相關(guān)關(guān)系，與其他合成相關(guān)酶活性均呈正相關(guān)關(guān)系，但EC、ECG、CAT含量與生物合成相關(guān)酶活性的相關(guān)性均表達到顯著水平。

另外，黃烷-3-醇生物合成相關(guān)酶活性與相關(guān)基因表達量間，除DFR活性與CHI、F3H、F3′H基因表達量，PAL活性與F3′H基因表達量為負相關(guān)外，其他合成相關(guān)酶活性與基因表達量間均為正相關(guān)，其中CHI基因表達量與各合成相關(guān)酶活性間相關(guān)性較弱，其他基因表達量與黃烷-3-醇生物合成相關(guān)酶活性相關(guān)性較強，除個別酶外，二者相關(guān)性達到顯著或是極顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

黃烷-3-醇是葡萄果實品質(zhì)評價的一個重要指標(biāo)，在決定葡萄酒的澀感、色澤及氧化等方面發(fā)揮重要作用[27-30]。本研究通過分析葡萄漿果發(fā)育過程中黃烷-3-醇單體含量的積累及相關(guān)酶基因的表達特征，為‘霞多麗’葡萄功能成分的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。趙權(quán)[31]研究結(jié)果表明，黃烷-3-醇類化合物含量在葡萄果實整個發(fā)育過程中呈下降趨勢。‘夏黑’葡萄果實中黃烷醇含量在花后21 ～42 d迅速增加至峰值，之后隨果實成熟逐漸下降，幼果期含量顯著高于成熟期[32]。本試驗結(jié)果表明，在‘霞多麗’葡萄果實發(fā)育的不同階段，其黃烷-3-醇類物質(zhì)在花后50 d之前積累最多，可能是因為這一時期的呼吸作用和新陳代謝強烈，之后檢測出的GC、ECG、CAT、EC含量均隨果實成熟下降，這與Fujita等[33]和Cadot等[34]的研究結(jié)果一致?！嘞贾椤咸压麑嵲谏L成熟過程中，兒茶素處于先積累，后下降至平穩(wěn)狀態(tài)，表兒茶素沒食子酸酯具有不穩(wěn)定性，總體呈下降狀態(tài)[6]。本研究中ECG在‘霞多麗’葡萄果實發(fā)育初期未檢測到，可能是因為這一時期ECG含量比較低；CAT含量隨著葡萄的成熟總體呈減少趨勢，這與王美麗[35]的研究結(jié)果相似；CAT等具有較強的抗氧化、抗衰老、抑菌等功能[36]，若考慮葡萄果實的功能作用，在完全成熟前采收是較好的時期。

酚類物質(zhì)是葡萄中重要的次生代謝物，其生物的合成和積累受到相關(guān)基因的調(diào)控， PAL、F3H、F3′H、CHI、DFR和ANS是黃烷-3-醇合成的相關(guān)酶，大量研究表明其基因參與了葡萄黃烷-3-醇的合成調(diào)控。彭東[37]、王愛華[38]等研究表明煙葉PAL活性隨煙葉成熟而增強，成熟后隨煙葉衰老而降低，本研究表明，‘霞多麗’果實發(fā)育過程中黃烷-3-醇生物合成相關(guān)酶PAL活性呈先升高后降低的變化趨勢，這與前人的研究結(jié)果相似；其余合成酶F3H、F3′H、CHI、DFR和ANS活性均隨著葡萄成熟而降低，可能是由于隨生育期的延長體內(nèi)生理代謝活動減弱所引起的。本研究同時發(fā)現(xiàn)，隨著‘霞多麗’葡萄果實的成熟，酚類物質(zhì)生物合成相關(guān)基因的表達也發(fā)生變化，這些基因的表達差異導(dǎo)致黃烷-3-醇積累模式的變化。其中，ANS基因表達量先上調(diào)后下調(diào)，后隨果實成熟逐漸上調(diào)，但仍低于花后20 d，這與馬雅娜[39]研究結(jié)果相似。

已有研究表明，石榴在果實發(fā)育期間ANS基因的表達與花色苷含量呈顯著正相關(guān)[40]，PAL基因的表達與煙葉中的類黃酮含量呈顯著正相關(guān)[23]。在本研究‘霞多麗’葡萄果實中，F(xiàn)3H、F3′H和ANS活性與GC含量達顯著正相關(guān)水平，表明F3H、F3′H和ANS活性對GC含量的積累影響較大。ANS、PAL基因的表達量與其ECG、GC含量呈正相關(guān)，即黃烷-3-醇含量與結(jié)構(gòu)基因表達量呈正相關(guān)關(guān)系，說明該基因可能是影響黃烷-3-醇含量的主要結(jié)構(gòu)因子，對ECG、GC含量合成的調(diào)控作用較強，基因表達量越高，越容易促進黃烷-3-醇類物質(zhì)的生物合成。另外，F(xiàn)3H基因表達量與F3′H活性，PAL基因表達量與DFR、ANS活性之間也存在極顯著正相關(guān)關(guān)系。因此可根據(jù)F3H、F3′H和ANS活性和ANS、PAL基因的表達量高低來判斷‘霞多麗’葡萄果實中黃烷-3-醇的合成積累水平。

綜上所述，在‘霞多麗’葡萄果實發(fā)育過程中，黃烷-3-醇單體含量隨果實成熟逐漸下降，黃烷-3-醇類物質(zhì)的積累與葡萄果實中其生物合成相關(guān)酶活性及相關(guān)基因表達有關(guān)。F3H、F3′H和ANS活性與‘霞多麗’葡萄果實中GC含量為顯著正相關(guān)；F3H、F3′H基因可能促進GC、CAT的合成，ANS、PAL基因促進ECG、GC的合成，CHI、DFR基因抑制GC的合成?？傊?，黃烷-3-醇生物合成的相關(guān)酶活性和相關(guān)基因表達影響了葡萄果實中黃烷-3-醇類化合物含量的積累，從而進一步影響葡萄酒的感官品質(zhì)。