劉 達，房郁坤，朱曉靜，羊雪芹

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江省器官發(fā)育與再生技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311121)

腭裂是常見的先天性顱面畸形之一，是由于胚胎在發(fā)育過程中受到遺傳和環(huán)境因素的影響而造成[1-3].在小鼠胚胎發(fā)育的第10.5天(E10.5)，中央鼻突與側(cè)鼻突和上頜突融合形成上唇和初生腭.E11.5兩個上頜突向口腔內(nèi)側(cè)生長形成左右腭原基突起，先在舌側(cè)向下垂直生長，然后在舌上方的水平生長，最終在中線處融合形成次生腭，至此形成完整的腭板(palate shelf).E16開始腭板分化成熟，在次生腭前部與初生腭融合骨化形成硬腭，在后部肌肉層與鼻中隔融合形成軟腭[4-6].腭板的器官發(fā)生和發(fā)育由上皮組織和相鄰的間充質(zhì)相互作用形成，并且受到多個信號通路和不同轉(zhuǎn)錄因子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)信號的調(diào)控，參與腭板發(fā)育過程中發(fā)生、提升、融合的重要基因的突變都可能導(dǎo)致腭裂[7-8].

腭板的發(fā)育是一個精密調(diào)節(jié)的過程，期間多個信號分子和轉(zhuǎn)錄因子(如WNT5A、MSX1、PAX9、SHOX2、FOX和TBX22)在腭板形態(tài)發(fā)生和器官形成中發(fā)揮作用[6-13].例如，介導(dǎo)非經(jīng)典Wnt信號通路的WNT5A能夠調(diào)節(jié)細胞增殖和遷移，影響小鼠腭板的發(fā)育[12]；轉(zhuǎn)錄因子SHOX2能夠調(diào)節(jié)小鼠硬腭發(fā)育過程的成骨分化和形成模式[9,14]；轉(zhuǎn)錄因子PAX9和FOXF在腭板間充質(zhì)中能調(diào)節(jié)腭上皮發(fā)育，突變小鼠腭板發(fā)育畸形[15-17].特異表達于后腭的TBX22最早在X染色體的轉(zhuǎn)錄定位中發(fā)現(xiàn)，人類TBX22突變與X連鎖的腭裂和唇腭裂相關(guān)[18-20]，小鼠Tbx22的上游轉(zhuǎn)錄因子MN1通過促進Tbx22的表達調(diào)節(jié)小鼠腭板的發(fā)育[21].同源盒轉(zhuǎn)錄因子MSX1是腭板發(fā)育的關(guān)鍵因子[13].有研究報道，作為中國人群的易感基因，唇腭裂現(xiàn)象中的MSX1遺傳力高于10%[22]，人類MSX1突變會導(dǎo)致唇腭裂和牙齒發(fā)育不全[23-24].小鼠Msx1缺陷會導(dǎo)致一些嚴重的顱面缺陷，包括腭裂、牙齒缺失和延遲骨化[25-26].有報道[26]顯示，Msx1-/-胚胎在妊娠期間短暫的缺氧應(yīng)激后發(fā)生唇裂.在Msx1-/-小鼠中，腭裂表型可以通過異位表達Bmp4誘導(dǎo)上皮細胞表達Shh，激活腭板間充質(zhì)Bmp2表達，刺激細胞增殖得到挽救[13].研究表明，在腭板前段(anterior palate，AP)，外源性BMP可有效誘導(dǎo)Msx1表達，并促進細胞增殖[13].

盡管已有研究明確了Msx1與腭板發(fā)育密切相關(guān)，但Msx1在腭板發(fā)育和生長模式中的分子調(diào)控機制仍然有待進一步研究.本研究建立Msx1條件性過表達小鼠，使用Wnt1-Cre工具小鼠與之交配，獲得在神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細胞中過表達Msx1的子代小鼠，研究Msx1在小鼠腭板發(fā)育中的作用及調(diào)控腭板發(fā)育的分子機制，以期為人類Msx1突變造成的腭裂的發(fā)病機制提供線索.

1 材料和方法

1.1 實驗動物及繁育鑒定

Msx1條件性過表達小鼠(Rosa-Flag-Msx1)為杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院顱面部器官發(fā)育實驗室構(gòu)建[25]，研究所用小鼠均飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)間內(nèi)，受到杭州師范大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會的監(jiān)督.

通過堿裂解法提取基因組DNA，加入2 μL作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體系為20 μL.利用引物P1：5’-CCGACTTGAGTTGCCTCAAG-3’，P2：5’-TAAGCCTGCCCAGAAGACTC-3’和P3：5’-TCGCCTTCTTGACGAGTTCTTC-3’擴增,進行小鼠基因型鑒定.

1.2 熒光定量PCR

使用RNA抽提試劑TRIzol (Invitrogen，美國)提取小鼠腭板組織的RNA，通過PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)合成cDNA.以組織cDNA為模板，18s作為內(nèi)參基因，采用SsoFast EvaGreen Supermix實時熒光定量PCR試劑盒(Bio-rad，美國)和實時熒光定量PCR儀 (Bio-Rad，美國)進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng).每個樣品3個重復(fù)，總反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA 1 μL.反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60～95 ℃溶解曲線，0.3 ℃增量.定量引物來自美國哈佛大學(xué)q-PCR引物數(shù)據(jù)庫Primerbank.

1.3 HE染色

收集E16.5的Msx1過表達小鼠和同窩野生型小鼠的腭板，經(jīng)4%多聚甲醛(PFA)固定后石蠟包埋，制備厚度為7 μm的組織切片.組織切片通過二甲苯—乙醇—蘇木精—伊紅—乙醇—二甲苯等不同試劑不同梯度染色處理后，由中性樹脂封片固定，顯微鏡觀察.

1.4 免疫組化

收集小鼠腭板，經(jīng)4%PFA固定、石蠟包埋.制備厚度為5 μm的組織切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、封閉后使用PHH3(Cell Signaling Technology，美國)、SP7 (Abcam，英國)、RUNX2 (Santa Cruz，美國)抗體進行免疫染色.

1.5 RNA-seq測序

從E12.5的Msx1過表達和同窩野生胚胎中分離出腭板，提取總RNA.由華大基因公司進行文庫構(gòu)建并進行RNA-seq測序分析.樣品收集和測序共進行了2次獨立重復(fù)實驗，差異表達基因的篩選標(biāo)準是Fold change(FC)≥1.5.原始序列數(shù)據(jù)已保存于中國科學(xué)院國家生物信息中心/北京基因組研究所國家基因組數(shù)據(jù)中心基因組序列檔案庫(https://bigd.big.ac.cn/gsa)，編號為CRA005453.

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用Graphpad Prism8軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Studentt檢驗進行顯著性分析，結(jié)果用M±SD表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 Msx1過表達小鼠的構(gòu)建和驗證

Msx1條件性過表達小鼠構(gòu)建見圖1.通過基因型鑒定，PCR鑒定結(jié)果為野生型258 bp條帶，Msx1純合條件性過表達小鼠為569 bp條帶，雜合鼠為258 bp和569 bp條帶.為獲得Msx1過表達的突變鼠，將Wnt1-Cre和Rosa-Flag-Msx1交配，獲得神經(jīng)嵴細胞來源的間充質(zhì)細胞中過表達Msx1的突變小鼠(RosaMsx1Wnt1-Cre)(圖2A)，如果過表達成功，該小鼠組織里也會有EGFP的表達.為進一步驗證Msx1在RosaMsx1Wnt1-Cre小鼠間充質(zhì)的過表達，使用熒光定量PCR分析了E12.5和E13.5腭板Rosa的熒光標(biāo)記基因EGFP以及Flag-Msx1的相對表達量(圖2B和2C).

圖1 Rosa-Flag-Msx1小鼠構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of Rosa-Flag-Msx1 mouse construct

熒光定量PCR結(jié)果顯示，和對照野生型小鼠比，RosaMsx1Wnt1-Cre小鼠E12.5和E13.5腭板組織中EGFP和Flag-Msx1的表達均顯著增高，提示Msx1在突變鼠腭板中成功過表達(圖2B和2C).E16.5，RosaMsx1Wnt1-Cre小鼠腭板的腭裂現(xiàn)象明顯，腭板前中后部均未融合(圖2A)，提示Msx1過表達可導(dǎo)致腭裂.

2.2 細胞增殖和細胞分化

為尋找Msx1過表達造成腭裂的生物學(xué)原因，分析了Msx1過表達和同窩野生型小鼠的腭板細胞增殖情況.使用PHH3抗體對小鼠腭板進行免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，Msx1過表達小鼠腭板在E12.5和E13.5，PHH3表達量有所降低，說明腭板細胞增殖減少(圖3A).在E14.5，野生鼠腭板上抬并對向生長，但是Msx1過表達小鼠腭板抬升并未完成.E14.5，PHH3表達量無明顯變化(圖3A)，在E12.5和E13.5，腭板細胞增殖顯著下調(diào)，E14.5無明顯變化(圖3B).

A: E12.5—E14.5腭板PHH3免疫熒光染色；B：A中腭板特定區(qū)域(方框)內(nèi)PHH3陽性細胞數(shù)統(tǒng)計分析；**P<0.01.

圖4 RosaMsx1Wnt1-Cre和同窩野生型小鼠腭板的 成骨細胞分化因子RUNX2和SP7的表達情況Fig.4 Expression of osteoblast differentiation factors RUNX2 and SP7 in palatal shelves of RosaMsx1Wnt1-Cre and their WT littermates

腭板發(fā)育過程中涉及成骨過程，本文研究Msx1過表達是否會影響腭板分化，選取骨分化的關(guān)鍵因子RUNX2和SP7作為研究對象.RUNX2又名核心結(jié)合因子(core-binding factor alhpal1)，是間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在成骨過程中起重要作用.SP7即OSTERIX，是一種新型含鋅指的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對成骨細胞增殖、分化和骨形成至關(guān)重要.結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，Msx1過表達小鼠腭板細胞RUNX2表達無顯著變化，SP7的表達明顯下調(diào)(圖4)，提示MSX1可能通過影響SP7來調(diào)節(jié)腭板骨分化.

2.3 RNA測序分析及驗證

收集E12.5Msx1過表達胚胎和同窩野生胚胎的腭板組織，進行RNA測序分析.RNA測序結(jié)果提示Msx1過表達腭板中有311個基因表達上調(diào)，471個基因表達下調(diào).其中，F(xiàn)oxc2、Foxl1、Foxd1、Foxd2、Alx3、Wnt2、Wnt16、Bmp3、Fgf7、Fgf14、Tbx22等基因在過表達Msx1腭板中均發(fā)生了顯著的表達變化(表1).結(jié)果表明,過表達Msx1與Foxc2、Foxl1、Foxd1、Foxd2和Alx3等的表達正相關(guān)，與Wnt2、Wnt16、Bmp3、Fgf7、Fgf14和Tbx22等的表達負相關(guān).采用熒光定量PCR對相關(guān)基因進行驗證(圖5)，結(jié)果提示Msx1對腭板發(fā)育關(guān)鍵基因的表達具有調(diào)控功能.

表1 Msx1過表達腭板和對照腭板組織關(guān)鍵差異表達基因Tab.1 Key differentially expressed genes in palates with Msx1 overexpression and control

**P<0.01.

3 討論

腭板發(fā)育是一個復(fù)雜過程，涉及許多基因及其編碼的生長因子和受體、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控，導(dǎo)致腭裂的基因突變和調(diào)控機制也不盡相同[10,27].研究[28-29]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Msx1對腭板嚴格的時空發(fā)育模式具有重要的調(diào)控作用.除基因敲除外，組織特異性過表達是研究基因與器官發(fā)育相互作用很好的研究方法[30-32].本研究結(jié)果表明，小鼠間充質(zhì)中過表達Msx1會導(dǎo)致腭裂，突變小鼠腭板細胞增殖下調(diào)，成骨細胞分化調(diào)節(jié)因子顯著下調(diào)，與之關(guān)聯(lián)的顱面部器官發(fā)育重要調(diào)節(jié)因子FOX、ALX、BMP、WNT和TBX等家族分子的基因表達也發(fā)生顯著變化.結(jié)果說明，Msx1在腭板發(fā)育的細胞增殖、細胞分化等方面起關(guān)鍵調(diào)控作用，并調(diào)控多種重要顱面器官發(fā)育基因的表達.

研究表明Msx1的表達與細胞增殖相關(guān).分離野生型小鼠胚胎的牙齒間充質(zhì)細胞并對Msx1進行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)Msx1表達下調(diào)會造成細胞增殖減少[33].在小鼠胚胎的肢芽發(fā)育中，Msx1能結(jié)合并上調(diào)成纖維細胞生長因子9(FGF9)和FGF18，促進細胞增殖[34].乳腺癌細胞中，抑制MSX1的表達，可誘導(dǎo)細胞周期變化和細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞增殖[35].PHH3是細胞核分裂的特異性標(biāo)志物，是構(gòu)成染色體主要成分的核心蛋白，能夠特異性識別磷酸化的組蛋白H3，因此PHH3常被用于識別真正的細胞有絲分裂[36].本研究通過檢測PHH3的表達，發(fā)現(xiàn)過表達Msx1小鼠的腭板細胞增殖水平有所降低，表明Msx1與腭板發(fā)育過程中細胞增殖密切相關(guān).

細胞分化對于器官功能的實現(xiàn)非常關(guān)鍵，腭板發(fā)育中骨細胞分化對于硬腭形成和腭板融合非常重要.研究表明Msx1與細胞分化關(guān)系密切，細胞模型中發(fā)現(xiàn)Msx1抑制成肌細胞分化[37]，小鼠模型中Msx1能夠調(diào)節(jié)顱骨骨細胞分化[38]，敲除小鼠中Msx1可促進成牙細胞分化[33]，在人類乳牙中MSX1參與并調(diào)節(jié)牙髓干細胞的成骨細胞分化過程[39].RUNX2和SP7都是影響成骨細胞分化的重要因子，Sp7是Runx2的下游基因[40].在腭板發(fā)育過程中，RUNX2能誘導(dǎo)細胞增殖，促進不成熟骨細胞向成骨細胞分化并調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育[41-42].SP7可以上調(diào)成熟骨細胞下游標(biāo)志物的表達，影響成骨細胞的遷移、凋亡和死亡，是腭板骨組織礦化所必需的[43-44].本研究中過表達Msx1小鼠腭板成骨的異常，主要原因可能不是腭板骨細胞增殖受到影響，而是調(diào)控腭板骨細胞分化和成熟的SP7表達降低，進而導(dǎo)致腭板成骨缺陷造成腭裂.

Msx1對介導(dǎo)哺乳動物顱面部器官發(fā)育中上皮-間充質(zhì)相互作用的生長因子網(wǎng)絡(luò)有重要的調(diào)控作用[45].哺乳動物胚胎發(fā)育中，涉及顱面部器官發(fā)育的基因有很多，例如：小鼠中敲除Alx3會抑制BMP誘導(dǎo)的成骨過程，下調(diào)成骨細胞分化，影響顱面部結(jié)構(gòu)和發(fā)育[46]；在顱面部間充質(zhì)表達的Fox家族基因充分參與顱面部器官的發(fā)育，小鼠Foxc2缺失會導(dǎo)致腭裂和顱面發(fā)育畸形，人類FOXC2缺陷會導(dǎo)致腭裂[47-49]；Tbx22敲除后小鼠成骨細胞成熟延遲，腭板間充質(zhì)骨化嚴重減少[50-51]；BMP信號通路對于顱面部器官發(fā)育也至關(guān)重要，其中BMP3是骨密度的負調(diào)控因子，對于骨發(fā)育和成骨具有調(diào)控作用[52]；以上研究結(jié)果與本研究RNA-seq測序結(jié)果相對應(yīng)，表明腭板發(fā)育中這些基因與Msx1的表達高度相關(guān)，協(xié)同調(diào)控哺乳動物腭板的發(fā)育.

綜上所述，本研究通過建立Msx1過表達小鼠模型，分析Msx1過表達小鼠腭裂的表型，研究其細胞增殖和腭板骨分化情況，進一步分析Msx1過表達小鼠腭板基因表達變化，研究結(jié)果為預(yù)防和治療腭裂提供新的思路.