頜骨缺損是口腔臨床治療中的常見疾病，研究發(fā)現(xiàn)相較于常規(guī)使用的骨移植物和純生物材料支架，攜帶生長因子的細胞復(fù)合支架材料，能夠更好地誘導(dǎo)骨組織再生

。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）經(jīng)不同的刺激或誘導(dǎo)后可分化為成骨細胞、脂肪細胞等，因此BMSCs 在骨組織工程中經(jīng)常作為種子細胞被用于相應(yīng)研究

。課題組前期將miRNA-378a 以慢病毒載體的形式轉(zhuǎn)入BMSCs 中研究其成骨及成血管性能，驗證了骨髓間質(zhì)干細胞為良好的種子細胞

。環(huán)狀RNA（circluar RNA，circRNA）小腦變性相關(guān)蛋白1 的反義轉(zhuǎn)錄物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as），是一種特殊的非編碼RNA，在骨組織修復(fù)中起到調(diào)控作用

。研究發(fā)現(xiàn)在股骨頭壞死患者中，circRNA CDR1as通過cirRNA-miR-7-5p-Wnt5B 通路在BMSCs 的成脂/成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用

。本實驗將過表達與低表達的circRNA CDR1as 慢病毒轉(zhuǎn)染至小鼠BMSCs，檢測BMSCs 中相關(guān)成骨、成血管因子的表達水平，以探究circRNA CDR1as 對BMSCs 成骨及成血管作用的影響，并判斷其能否為后期修復(fù)骨缺損奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器

4 周齡SPF 級Balb/C 小鼠，雌雄不限，15～25 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK（新）2016-0003，實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準（動物倫理審核項目編號：IACUC20170706-04）。

由表2可見，在D7，各用藥組AGP效價明顯高于疫苗對照組，但差異不顯著(P>0.05)；在D14，中藥復(fù)方多糖AGP效價顯著高于疫苗對照組(P<0.05)；在D 21和D28，中藥復(fù)方多糖組AGP抗體效價顯著高于黃芪多糖組和疫苗對照組(P<0.05)；在D35中藥復(fù)方多糖組AGP效價顯著高于疫苗對照組(P<0.05).

北方的冬天，充滿了快樂。下雪了，鵝毛般的大雪紛紛揚揚地飄了下來，落在地上、樹枝上、屋頂上……不多時，到處已經(jīng)是白茫茫的一片。

低糖DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；Balb/C 小鼠BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（Cyagen，中國）；實時定量PCR 引物合成（上海生物工程公司，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）；Real-Time PCR 試劑盒（Takara，日本）；增強型CCK-8（Bioss，北京）；熒光定量PCR 儀（QuantStudio

6Flex，Thermo，美國）；流式細胞儀（BD facsaria，美國）；高速離心機（5810R，Eppendorf，德國）；酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）；倒置相差顯微鏡（萊卡，德國）。CCK-8試劑盒（Bioss，中國），茜素紅（北京索萊寶公司，中國），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）（北京索萊寶公司，中國），慢病毒（上海吉凱基因科技有限公司，中國）。

（2）整合業(yè)務(wù)流程及數(shù)據(jù)信息，實現(xiàn)跨部門協(xié)同服務(wù)。開放式流程平臺打破了各部門、各系統(tǒng)間的壁壘，以先進的流程服務(wù)理念，將分散在各領(lǐng)域的業(yè)務(wù)流程及數(shù)據(jù)信息有效的整合起來，使高校各部門真正協(xié)同服務(wù)成為可能。

過表達circRNA CDR1as 慢病毒來自circbase數(shù)據(jù)庫的mmu_circ_0001878 過表達的序列，使用的載體元件順序：CMV-circRNA-EF1-ZsGreen1-T2Apuromycin，過表達陰性對照組的載體元件順序MVcircRNA-EF1-ZsGreen1-T2A-puromycin，是一個空載體。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率 各組細胞培養(yǎng)72 h 后，胰酶消化收集細胞，流式檢測各組慢病毒載體轉(zhuǎn)染后增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表達效率。同時將各組細胞收集后按照1 × 10

個/mL 的細胞密度分別接種到激光共聚焦小皿培養(yǎng)24 h，共聚焦顯微鏡觀察EGFP 熒光數(shù)量。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分離培養(yǎng)與鑒定 麻醉Balb/C 小鼠后頸椎脫臼處死，75%乙醇溶液浸泡5 min，無菌條件下分離肱骨和股骨，剪去兩端干骺端，用低糖DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、0.5%鏈霉素、0.5%青霉素及1%谷氨酰胺）沖出骨髓，離心（5 min，1 000 r/min，22 ℃）后加入完全培養(yǎng)基重懸細胞于培養(yǎng)瓶中，置入恒溫培養(yǎng)箱，每72 h 換液，待細胞密度長至85%～90%時，0.25%胰酶消化傳代。取第3 代BMSCs 加入特異性表達抗體CD29 和CD31 上流式細胞儀檢測。

過表達實驗組ALP 染色面積多于過表達對照組，而低表達實驗組ALP 染色面積少于其對照組，隨著成骨誘導(dǎo)天數(shù)的增加，各組的ALP 染色面積逐漸增大（圖5）。

各組細胞轉(zhuǎn)染72 h 后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察攜帶EGFP 綠色熒光的細胞，DAPI 染色后細胞核鏡下呈藍色熒光；明場圖觀察細胞數(shù)量，各組細胞轉(zhuǎn)染率無明顯差異；使用流式細胞儀檢測EGFP 表達效率，過表達實驗組轉(zhuǎn)染率為88.7%，過表達對照組為77.3%；低表達實驗組轉(zhuǎn)染率為81.9%，低表達對照組為68.8%，四組轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

＞0.05）（圖2）。

根據(jù)所測OD 值，繪制4 組細胞生長曲線圖，類似“S”形，4 組細胞1 d、2 d 增殖速率較緩和，各組細胞增殖活性無統(tǒng)計學(xué)差異（

＞0.05），7 d 時增至最高，8 d 時細胞增殖速率開始減緩；3～10 d，過表達實驗組細胞增殖活性高于過表達對照組（

＜0.05），而低表達實驗組細胞增殖活性低于低表達對照組（

＜0.05）（圖3）。

低表達組和低表達對照組，使用的載體元件順序hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，低表達circRNA CDR1as 慢病毒靶點序列1：5’-TCTGCCGTATCC AGGGTTT - 3’，低表達 circRNA CDR1as 慢病毒靶點序列2：5’-TATCCAGGGTTT CCAGTGG-3’；低表達對照組序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

隨著成骨誘導(dǎo)天數(shù)的延長，每組紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量相應(yīng)增多，由單一鈣結(jié)節(jié)變?yōu)閳F塊狀鈣結(jié)節(jié)。同一時間段內(nèi)，過表達實驗組紅色鈣化區(qū)域大于過表達對照組；而低表達實驗組紅色鈣化區(qū)域少于其對照組（圖4）。

1.2.5 茜素紅染色 各組BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h 后，加入成骨誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)14、21 d 后染色。多聚甲醛固定，超純水洗滌，茜素紅染液染色，超純水洗滌，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)區(qū)域。

1.2.6 堿性磷酸酶染色 各組BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h 后，成骨誘導(dǎo)14、21 d 后染色。2 mL 4%多聚甲醛固30 min，蒸餾水洗3 遍，按比例加入堿性磷酸酶染色液，避光孵育20～30 min，直至顯色至預(yù)期深淺，蒸餾水洗2 遍，倒置相差顯微鏡下觀察鈣沉淀區(qū)域。

1.2.7 qRT-PCR檢測成骨成血管相關(guān)基因表達 BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h 后，Trizol 法提取各組總RNA，測量濃度與純度。使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒兩步法將RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA，以20 μL 體系進行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環(huán)。檢測各組circRNA CDR1as 基因，成骨分化特異標(biāo)志物ALP、Runt 相關(guān)基因2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋素（osteopontin，OPN）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen-I，COL-1），以及成血管特異標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial grown factor，VEGF）、血管生成素-1（angiogenin-1，Ang-1）的mRNA 表達水平，實驗至少重復(fù)3 次。qRT-PCR 所用引物見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0 進行分析，符合正態(tài)性，選用兩獨立樣本

檢驗，各組基因的表達量通過2

計算，實驗數(shù)據(jù)以表示，

＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計圖使用GraphPad Prism 軟件繪制。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs 培養(yǎng)及鑒定

生長良好的3 代細胞多為長梭狀，生長密集呈旋渦狀；流式細胞術(shù)檢測細胞表面特異性抗體CD29陽性表達（93.1%），而CD31陰性表達（2.4%），符合BMSCs 的表型特點（圖1）。

2.2 BMSCs 轉(zhuǎn)染效率

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 將3 代BMSCs 按細胞密度為5 × 10

個/孔接種于6 孔板，細胞長至60%左右時，根據(jù)說明書確定轉(zhuǎn)染時病毒滴度，按照轉(zhuǎn)染慢病毒載體的不同分為circRNA CDR1as 過表達組（過表達實驗組）和circRNA CDR1as 低表達組（低表達實驗組）以及分別相對應(yīng)的陰性對照組，每孔轉(zhuǎn)染液體總量1 mL，放入培養(yǎng)箱中，24 h 后換液，2 mL/孔培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察72～96 h 轉(zhuǎn)染情況。

2.3 CCK-8 細胞毒性檢測

倘若能將我們的設(shè)想與現(xiàn)實結(jié)合，將會吸引來大批高校學(xué)生的向往，在互聯(lián)網(wǎng)時代，什么都很便利了，人們的生活質(zhì)量提高，對于服務(wù)的追求越來越高，只有以客戶為中心，才能為我們引來更多的人流量，進而才能實現(xiàn)共贏，客戶得到了美的體驗，商家得到了利益。然而在這過程中，應(yīng)當(dāng)對商家進行嚴格的要求，切勿追捧蠅頭小利，而送走了客戶。

2.4 茜素紅染色結(jié)果

1.2.4 CCK-8 檢測細胞毒性 各組BMSCs 轉(zhuǎn)染72 h后，按照1 000 個/孔的細胞密度接種至96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8液孵育，2 h 后測OD

值，每隔24 h 檢測1 次，連續(xù)測10 d，檢測病毒轉(zhuǎn)染后對BMSCs 增殖的影響。

2.5 ALP 染色結(jié)果

4.2.5 標(biāo)本放反 在觀察細胞形態(tài)時，如白細胞分類通常使用油鏡觀察，但血涂片經(jīng)染色后，有的學(xué)生會把標(biāo)本反放在載物臺上。因為油鏡頭鏡口率較小，需要標(biāo)本非常接近油鏡頭，如果放反，物體超出了顯微鏡工作距離，無論如何也找不到物像。解決方法：（1）發(fā)現(xiàn)載玻片放反，直接翻轉(zhuǎn)過來；（2）在制作載玻片時在其一端做標(biāo)記，防止觀察時放反。

2.6 各組成骨及成血管相關(guān)基因mRNA 表達

circRNA CDR1as 的mRNA 表達水平，在低表達實驗組中circRNA CDR1as 的表達顯著降低（

＜0.001），在過表達實驗組中顯著增高（

＜0. 001）。RUNX2、ALP、VEGF、Ang-1、OSX、COL-1、OCN 和OPN 的mRNA 表達水平在過表達實驗組中高于其對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

＜0.001）；RUNX2、ALP、VEGF、Ang-1、OSX、COL-1、OCN 和OPN 的mRNA 表達水平在低表達實驗組中低于其對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

＜0.001）（圖6）。

3 討 論

近年在組織工程骨的研究中，circRNA 為骨組織疾病及干細胞成骨分化方面注入了新的“血液”

。研究發(fā)現(xiàn)，在人類和小鼠的神經(jīng)元細胞中，circRNA CDR1as 被微小RNA（microRNA，miRNA）-7 和miRNA-671 所調(diào)控，兩者通過敲除circRNA CDR1as 的基因片段而對細胞發(fā)揮不同的刺激作用

。本實驗通過以慢病毒載體的方式，轉(zhuǎn)染circRNA CDR1as 至小鼠BMSCs 中以檢測circRNA CDR1as 對骨髓干細胞成骨和成血管基因表達的影響，為后期轉(zhuǎn)染過circRNA CDR1as 的BMSCs 膜片包裹生物支架材料修復(fù)骨缺損奠定實驗基礎(chǔ)，以探索circRNA CDR1as 在骨組織工程中的研究價值。本研究中，分別將過表達與低表達circRNA CDR1as 基因和空載慢病毒轉(zhuǎn)染至BMSCs 中，通過流式細胞術(shù)檢測各組的轉(zhuǎn)染效率，四組轉(zhuǎn)染效率無統(tǒng)計學(xué)差異。激光共聚焦顯微鏡觀察到BMSCs轉(zhuǎn)染72 h 后，細胞貼壁生長且形態(tài)規(guī)則，呈扁梭角形且觸角短小，由此可知慢病毒對細胞的形態(tài)無明顯影響。同時CCK-8 生長曲線結(jié)果顯示，circRNA CDR1as 過表達實驗組細胞增殖率3～10 d高于其對照組，而circRNA CDR1as 低表達實驗組細胞增殖率3～10 d 低于其對照組，提示過表達circRNA CDR1as 可促進BMSCs 增殖，而低表達circRNA CDR1as 可抑制BMSCs 增殖。

骨缺損修復(fù)的過程中往往伴隨著成骨和成血管因子的基因變化，課題組前期左新慧等

通過在BMSCs 中過表達與低表達低氧誘導(dǎo)因子，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)成骨和成血管基因的不同表達水平。Peng等

的研究指出，在上頜竇膜干細胞的成骨分化期間，OSX 的mRNA 表達水平隨著circRNA_33287 的過表達或沉默而增加或降低。Xu 等

在骨質(zhì)疏松癥患者中構(gòu)建了circRNA_0011269-miRNA 靶標(biāo)結(jié)合的網(wǎng)絡(luò)，并在該網(wǎng)絡(luò)中探尋到miR-122；利用雙熒光素酶報告驗證了miR-122 與circRNA_0011269/RUNX2 的靶向關(guān)系；并證實circRNA_0011269 的過表達可以促進RUNX2 的表達并抑制骨質(zhì)疏松癥。ALP 和RUNX2 是成骨細胞的早期標(biāo)志物，反映了成骨細胞的分化能力，同時可以將BMSCs 的相關(guān)成骨基因進行定向分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯

。本實驗結(jié)果顯示當(dāng)過表達或低表達circRNA CDR1as 作用于BMSCs 時，ALP 和RUNX2 的mRNA 的表達水平分別呈升高和下降趨勢。OCN 是細胞骨向分化的晚期標(biāo)志物，能靈敏反映成骨細胞活性和骨轉(zhuǎn)換狀況

。OPN 廣泛存在于骨細胞中，充當(dāng)催化劑作用，加速類骨質(zhì)的礦化和成骨細胞的形成

。OSX 是一種特殊的成骨分化轉(zhuǎn)錄因子，其特殊性是只在骨組織細胞中表達，是骨形成所必需的相關(guān)因子

。COL-1 由成骨細胞分泌，在成骨細胞早期形成階段表現(xiàn)活躍，其表達活性持續(xù)至骨成熟階段

。本實驗OCN、OPN、OSX、COL-1 的mRNA表達水平過表達組呈增高趨勢，而低表達組呈下降趨勢，提示過表達circRNA CDR1as 促進BMSCs的成骨分化。VEGF 可促進血管內(nèi)皮細胞增生和新生血管形成，是成血管的關(guān)鍵指標(biāo)

。Ang-1 在吸引血管周細胞、促進血管重塑和成熟等方面具有重要作用，可進一步增強內(nèi)皮細胞屏障的完整性

。本實驗中，成血管標(biāo)志物VEGF、Ang-1 隨著circRNA CDR1as 的過表達和低表達而分別增高和降低，提示當(dāng)過表達或低表達circRNA CDR1as 作用于BMSCs 時，可以調(diào)節(jié)BMSCs 中的成骨-血管生成偶聯(lián)過程。Li 等

發(fā)現(xiàn)當(dāng)過表達或敲低circRNA CDR1as 作用于牙周膜干細胞時，觀察到過表達的circRNA CDR1as 促進成骨細胞分化，而敲低的circRNA CDR1as 抑制了ALP 的活性和成骨基因的表達，以及ALP 和茜素紅礦物沉積的減少，證實了circRNA CDR1as 參與了牙周膜干細胞成骨分化的調(diào)節(jié)。本實驗中，對各組的茜素紅染色和ALP染色結(jié)果證明了circRNA CDR1as 對BMSCs 的成骨分化具有調(diào)節(jié)作用。

《背影》是朱自清先生寫于1925年的一篇回憶性散文，講述了普通小人物的平凡小事。文章以“我”的視野記錄了1917年離開南京前往北京大學(xué)求學(xué)，父子二人車站送別的情景。在人物描寫方面本文不同于一般的抒情散文，它沒有做過多的人物神情、心理、外貌的描寫，而是細致刻畫了父親的“背影”。對于《背影》這一經(jīng)典敘事性散文的研究，大致分為兩種類型：一種是從文本解讀的角度分析課文的主題、情感、人物形象等內(nèi)容，《背影》隨著時代的變遷，人們對其主題的解讀也是日漸不同。另一種則是從課堂教學(xué)的角度探討教學(xué)技巧，教學(xué)方式，研究課堂實錄。本文主要研究黃厚江《背影》的課堂實錄，對他的教學(xué)語言風(fēng)格做一個解析。

綜上所述，本實驗通過構(gòu)建慢病毒載體的方式，將過表達和低表達的circRNA CDR1as 轉(zhuǎn)染至BMSCs 中，證實了circRNA CDR1as 對BMSCs 的成骨及成血管基因起到一定的調(diào)控作用，為circRNA結(jié)合干細胞修復(fù)骨缺損提供了新思路。但本實驗僅限于體外細胞學(xué)實驗，后期將復(fù)合生物支架進行動物回植實驗，進一步證實circRNA CDR1as 在體內(nèi)的成骨及成血管的能力，以期更好的使其應(yīng)用于組織工程中。

【Author contributions】 Yang WZ performed the experiments and wrote the article. Zheng MJ performed the experiments. Han XZ and Zhou QQ revised the article. He HY designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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