張佳惠,劉恒,王玉田,姜宏

(1 青島大學(xué)國家生理學(xué)重點(培育)學(xué)科，山東 青島 266071； 2 Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health and Department of Medicine, University of British Columbia, Vancouver, BC, V6T 2B5, Canada)

在帕金森病(PD)中，α-突觸核蛋白(α-syn)在Ser-129 位點的磷酸化促進(jìn)了α-syn的積累及路易小體的形成，對PD的發(fā)生發(fā)展起到重要作用[1-4]。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體為離子型谷氨酸受體，具有高鈣離子通透性，在學(xué)習(xí)與記憶中發(fā)揮重要作用[5-6]。該受體過度激活會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和死亡，被認(rèn)為是與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的神經(jīng)元損傷的介質(zhì)[7-8]。NMDA受體GluN2B亞基的C末端可以被酪氨酸激酶Fyn激活而發(fā)生磷酸化聚集在突觸后膜上，而細(xì)胞內(nèi)Fyn的表達(dá)可能受到α-syn的調(diào)控[9-10]。然而，NMDA 受體參與PD的發(fā)病機(jī)制仍然不明確。本實驗旨在通過檢測α-synA53T 轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型(WT)小鼠黑質(zhì)區(qū)(SN)磷酸化GluN2B(p-GluN2B)蛋白表達(dá)水平，探究隨PD進(jìn)展GluN2B亞基活性變化，以期為PD提供潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物α-synA53T轉(zhuǎn)基因小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所，進(jìn)行基因型鑒別，獲得α-synA53T+/+小鼠和α-synA53T+/-小鼠。本實驗選擇12～15月齡的α-synA53T+/+小鼠和同窩WT小鼠各5只作為研究對象。小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，設(shè)定室溫為(22±2)℃、白晝與黑夜的光照時間為1∶1。

1.1.2儀器及試劑 p-GluN2B抗體(ABcam)；磷酸化α-syn(pS129 α-syn)抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔二抗(Absin)；BCA試劑盒、SDS-PAGE loading buffer、RIPA裂解液、分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液(康為世紀(jì))；ECL顯色發(fā)光液、PVDF膜(Millipore)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(BioRad)；凝膠成像系統(tǒng)(General Electric Company)。

1.2 實驗方法

1.2.1曠場實驗 應(yīng)用50 cm×50 cm的方盒曠場，方盒周壁及底部的顏色均不透明，將方盒底部平均分為4×4的16個小方格。攝像頭置于方盒上方，可觀察整個曠場，將小鼠輕輕放置在方盒中，黑暗中進(jìn)行10 min的視頻錄制。每只小鼠測試結(jié)束后，清理方盒并應(yīng)用乙醇消除氣味后晾干，以防對下一只小鼠測試產(chǎn)生影響。采用SMART軟件分析小鼠總運動距離及平均運動速度等數(shù)據(jù)。

1.2.2蛋白免疫印跡法檢測SN區(qū)蛋白表達(dá) 小鼠麻醉后斷頭取腦，在冰上按照腦圖譜完整取出中腦SN區(qū)。向腦組織中加入100 μL RIPA蛋白裂解液靜置，置于研磨機(jī)中研磨。在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，離心結(jié)束后取上清液80 μL，在酶標(biāo)儀上用BCA 法測定蛋白濃度。加入5×蛋白loading buffer混勻，100 ℃金屬浴煮沸，根據(jù)BCA法檢測數(shù)據(jù)確定上樣量。按照所需蛋白分子量配膠，電泳完成以后轉(zhuǎn)膜(300 mA、100 min)。按照Marker切下需要的目標(biāo)條帶，用100 g/L脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h；分別加入用一抗稀釋液配制的p-GluN2B抗體(1∶1 000)、pS129 α-syn 抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶10 000)，置低速搖床上4 ℃孵育過夜；以TBST緩沖液洗脫3次，半小時后加入山羊抗兔的二抗(1∶10 000，TBST緩沖液配制)，置搖床上室溫孵育1 h；以TBST緩沖液洗脫3次，擦干TBST后，加入適量ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。采用Image J軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以p-GluN2B、pS129 α-syn與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 α-syn A53T+/+小鼠運動行為能力改變

α-synA53T+/+小鼠和WT小鼠在開放曠場的總運動距離分別為(2 575.0±293.7)、(3 655.0±225.1)cm(n=5)，α-synA53T+/+小鼠曠場總運動距離較WT小鼠減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.920，P<0.05)。α-synA53T+/+小鼠和WT小鼠的平均運動速度分別為(4.302±0.480)、(5.898±0.415)cm/s(n=5)，α-synA53T+/+小鼠平均運動速度較WT小鼠減慢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.518，P<0.05)。

2.2 α-syn A53T+/+小鼠中腦SN區(qū)p-GluN2B 和pS129 α-syn蛋白表達(dá)變化

α-synA53T+/+小鼠和WT 小鼠中腦SN區(qū)p-GluN2B蛋白的表達(dá)水平分別為1.115±0.141和0.706±0.087(n=5)，α-synA53T+/+小鼠SN區(qū)p-GluN2B蛋白的表達(dá)水平較WT小鼠明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.470，P<0.05)。α-synA53T+/+小鼠和WT 小鼠SN區(qū)pS129 α-syn 蛋白的表達(dá)水平分別為1.277±0.219和0.433±0.094(n=5)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.533，P<0.05)。

3 討 論

NMDA受體為谷氨酸門控離子通道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，并在興奮性突觸傳遞中起著關(guān)鍵作用[11]。NMDA受體共包含3種類型的亞基(GluN1～3)，亞基結(jié)構(gòu)間具有高度同源性，均由氨基端、配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及羧基末端4個結(jié)構(gòu)域組成[12-13]。越來越多的研究表明，在PD細(xì)胞模型和PD病人腦組織中，紋狀體和伏隔核中谷氨酸與NMDA受體結(jié)合顯著增加，而這可能會加速神經(jīng)元退化過程[14-15]。有文獻(xiàn)報道，在亞急性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)小鼠模型中，可以通過抑制mGlu2/3受體配體影響突觸后Fyn/NMDA受體的功能[16]。最新的研究結(jié)果表明，在魚藤酮小鼠模型中，GluN2B在mGluR5介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷中發(fā)揮著重要作用[17]。

上述研究揭示，在PD的進(jìn)展過程中，NMDA受體介導(dǎo)的谷氨酸興奮性毒性發(fā)揮作用。本文研究結(jié)果顯示，12～15月齡α-synA53T+/+小鼠運動能力受損，與之前有關(guān)研究報道相吻合[18]。本文結(jié)果還顯示，α-synA53T+/+小鼠SN區(qū)pS129 α-syn和p-GluN2B蛋白表達(dá)水平明顯升高，說明在SN區(qū)出現(xiàn)了α-syn聚集，從而可能過度激活Fyn使GluN2B亞基表達(dá)過磷酸化。有研究報道，F(xiàn)yn在Tyr1472處磷酸化GluN2B會抑制與網(wǎng)格蛋白接頭AP-2的結(jié)合，最終會抑制細(xì)胞表面含有GluN2B的NMDA受體的內(nèi)化[19-20]。因此我們推測，當(dāng)p-GluN2B增多時，由于Fyn活性增強(qiáng)使GluN2B內(nèi)化減少，導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流，這可能成為神經(jīng)元損傷的重要原因。本研究為闡明NMDA受體參與PD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了思路，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。