石 悅，劉拴成，房永雨，丁海君，呂二鎖，路玉紅

（1.集寧師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古集寧 012000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.敖漢旗四家子鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，內(nèi)蒙古四家子 024300）

高丹草是高粱與蘇丹草的種間雜交品種，分蘗多、產(chǎn)草量高、抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)、適口性好、再生能力強(qiáng)，可多次刈割飼喂家畜[1-2]，飼用價(jià)值和生態(tài)價(jià)值高。近年來，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牧草遺傳性狀差異分析、圖譜構(gòu)建及相關(guān)性狀QTL 定位和新品種選育研究，如RAPD[3]、SSR[4-5]、EST-SSR[6]、ISSR[7]、AFLP[8]、SRAP[9]等分子標(biāo)記技術(shù)均有報(bào)道。關(guān)于高丹草分子標(biāo)記體系優(yōu)化的研究報(bào)道，李杰勤等[3]研究不同因素水平（Mg2+、退火溫度和Taq 酶含量）對(duì)蘇丹草RAPD 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，確定蘇丹草RAPD 反應(yīng)體系的最優(yōu)條件。溫瑩等[6]選取14 對(duì)引物，對(duì)50 份高丹草、3 份蘇丹草和7 份高粱進(jìn)行EST-SSR 擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)（sequence -related amplified polymorphism）是由LI 等[10]提出的一種利用特殊引物設(shè)計(jì)對(duì)開放閱讀框架（ORFs）進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增的新分子標(biāo)記技術(shù)，其多態(tài)性是由不同作物的啟動(dòng)子和內(nèi)含子與間隔區(qū)域長(zhǎng)度不同產(chǎn)生的。SRAP 分子標(biāo)記具有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、共顯性強(qiáng)、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、正向和反向引物可通過自由組合形成引物對(duì)而降低合成引物費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)。目前，SRAP-PCR分子標(biāo)記的擴(kuò)增體系已應(yīng)用于多種作物，如馬鈴薯[11]、結(jié)縷草屬植物[12]、石斛屬植物[13]等，但迄今還未見關(guān)于高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化和引物篩選的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)以高丹草基因組DNA 為模板，采用單因素水平和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的5 個(gè)因素（dNTP、DNA、引物、Taq DNA 聚合酶、Mg2+）進(jìn)行試驗(yàn)體系優(yōu)化和適宜引物篩選，旨在建立適合高丹草SRAR-PCR 的最佳反應(yīng)體系，從而為高丹草遺傳差異分析、新品種選育、遺傳作圖及相關(guān)性狀QTL 精細(xì)定位等研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為蒙農(nóng)9 號(hào)高丹草（散穗高粱×紅殼蘇丹草）部分單株，種植于集寧師范學(xué)院植物園試驗(yàn)基地。

1.2 基因組DNA 提取

拔節(jié)期剪取高丹草幼嫩葉片裝入塑封袋，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，將葉片剪碎稱取1.0 g，用植物基因組試劑盒提取樣品DNA，檢測(cè)基因組DNA 的純度（1.4%瓊脂糖凝膠電泳），并將DNA 稀釋至50 ng/μL，于-80 ℃冰箱備用。

1.3 SRAP 引物來源及程序

SRAP 引物采用LI 等[10]報(bào)道的引物序列，正向引物和反向引物堿基序列見表1。本試驗(yàn)由6 對(duì)正向引物（m2、m4、m5、m9、bm8、bm9）和9 對(duì)反向引物（e2、e4、e6、e9、k2、k4、be10、coe7、coe9）隨機(jī)組合形成的54 對(duì)SRAP 引物序列，委托上海生物工程公司合成。高丹草SRAP-PCR 擴(kuò)增程序參照李佳奇等[14]基于SRAP 分子標(biāo)記構(gòu)建冰草遺傳圖譜中的程序。

表1 SRAP 引物的堿基序列

1.4 優(yōu)化高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系

1.4.1 SRAP-PCR反應(yīng)體系單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以引物m5be10 進(jìn)行SRAP-PCR 體系優(yōu)化，結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)方法：（1）對(duì)高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系的5 個(gè)因素設(shè)置水平梯度，篩選適宜濃度區(qū)域；（2）利用正交試驗(yàn)每個(gè)因素設(shè)置8 個(gè)濃度梯度水平，確定最優(yōu)組合（表2）。優(yōu)化試驗(yàn)前需做預(yù)試驗(yàn)，設(shè)定SRAP-PCR反應(yīng)體系各因子參數(shù)為濃度梯度的中間值，分別為：模板DNA 濃度3.0 ng/μL、Mg2+濃度2.50 mmol/L、Taq DNA 聚合酶用量1.00 U、dNTP 濃度200 μmol/L、引物濃度1.0 μmol/L，最后用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

表2 SRAP-PCR反應(yīng)體系單因素試驗(yàn)

1.4.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以影響高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系的5 個(gè)因素（dNTP、DNA、引物、Taq DNA 聚合酶和Mg2+）以及利用單因素試驗(yàn)確定的4 個(gè)最優(yōu)濃度梯度水平進(jìn)行體系篩選（表3），即利用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)處理組合重復(fù)3 次。依據(jù)SRAP-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶數(shù)目、多態(tài)性情況、電泳結(jié)果清晰程度、是否有雜帶等，對(duì)16 個(gè)試驗(yàn)組合進(jìn)行評(píng)定打分[15-16]。以擴(kuò)增條帶多態(tài)性豐富且清晰為最高分（16 分），條帶數(shù)少且模糊不清為最低分（1 分），其余組合按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劃分為2～15 分。

表3 SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5 高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化驗(yàn)證

以雙親基因組DNA 作為對(duì)照，對(duì)高丹草基因組DNA 進(jìn)行SRAP-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，依據(jù)表1 列出的引物進(jìn)行自由組合，以bm8e6、m4e9、bm9e4、m5e9、m9e9、m9e2、m9e4 和m9k4 引物對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證上述優(yōu)化反應(yīng)體系的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料DNA 純度和濃度檢測(cè)

采用植物基因組試劑盒提取高丹草幼嫩葉片DNA，經(jīng)純度電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，DNA 純度較高、條帶清晰、無降解、無雜質(zhì)、質(zhì)量好；用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各供試材料的DNA，濃度為50 ng/μL，經(jīng)電泳檢測(cè)條帶清晰、純度高，可用于SRAP-PCR 擴(kuò)增（圖1）。

圖1 試驗(yàn)材料DNA 電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 dNTP 濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

SRAP-PCR 延伸過程中，dNTP 主要影響DNA模板鏈的形成，其濃度高低可影響PCR 擴(kuò)增效果的準(zhǔn)確性、條帶數(shù)量、特異性、聚合酶的活性。在其他因素不變的條件下，dNTP 濃度梯度由圖2a 可知，隨著dNTP 濃度的逐漸增加，在濃度為250 μmol/L 和275 μmol/L 時(shí)，擴(kuò)增條帶最多且清晰穩(wěn)定；當(dāng)濃度增加到300 μmol/L 時(shí)，條帶清晰但數(shù)量有所減少，因此正交試驗(yàn)選用的dNTP 濃度為200～275 μmol/L 。

2.2.2 DNA 濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

DNA 作為SRAP-PCR反應(yīng)體系模板，其純度（有無降解和其他雜質(zhì)污染等情況）和濃度大小影響擴(kuò)增結(jié)果。試驗(yàn)對(duì)模板DNA 設(shè)置8 個(gè)濃度梯度（0.5～4.0 ng/μL）。由圖2b 可知，DNA 濃度為0.5 ng/μL 時(shí)，背景模糊不清、條帶數(shù)量最少且多態(tài)性效果差；當(dāng)SRAP-PCR 體系體積為20 μL，DNA 濃度在1.0～3.5 ng/μL 時(shí)，高丹草電泳條帶數(shù)目有所增加、分布范圍廣（100～1 500 bp）、背景清晰；綜合電泳擴(kuò)增效果，正交試驗(yàn)確定模板DNA 濃度為2.0～3.5 ng/μL。

2.2.3 引物濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

引物濃度對(duì)于SRAP-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增效率起著主要作用，過高或過低都會(huì)增加引物與模板DNA 的錯(cuò)配率，導(dǎo)致條帶特異性差。由圖2c 可知，引物濃度太低，如0.6 μmol/L 和0.7 μmol/L 時(shí)，PCR 擴(kuò)增條帶數(shù)少且不清晰；濃度過高，如1.2 μmol/L和1.3 μmol/L 時(shí)，條帶模糊且數(shù)量減少，試驗(yàn)效果不好；引物濃度在0.8～1.1 μmol/L 時(shí)，隨著濃度增加擴(kuò)增條帶豐富且清晰，因此正交試驗(yàn)選用的引物濃度為0.8～1.1 μmol/L。

2.2.4 Taq DNA 聚合酶用量對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

Taq DNA 聚合酶在SRAP-PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)中起到直接影響作用。以DNA 為模板合成新鏈時(shí)，Taq DNA聚合酶起到了關(guān)鍵作用，濃度過高會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，濃度過低擴(kuò)增條帶數(shù)少且效果差。由圖2d 可知，Taq DNA 聚合酶用量為0.50 U 時(shí)，條帶背景模糊、條帶數(shù)少；Taq DNA 聚合酶用量為2.00 U 和2.25 U時(shí)，條帶數(shù)雖然多但不清晰，Taq DNA 聚合酶用量影響PCR 擴(kuò)增效果；Taq DNA 聚合酶用量在0.75～1.50 U時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶豐富且清晰穩(wěn)定，因此正交試驗(yàn)選用的Taq DNA 聚合酶用量為0.75～1.50 U。

圖2 不同濃度水平高丹草單因素的SRAP-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2.5 Mg2+濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響

Mg2+濃度會(huì)在一定程度上影響Taq DNA 聚合酶活性，導(dǎo)致引物、模板DNA、dNTPs 產(chǎn)生結(jié)合現(xiàn)象。由2e 可知，Mg2+濃度在1.25～2.00 mmol/L 時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶少、背景模糊、效果差；Mg2+濃度在2.25～3.00 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶豐富且清晰穩(wěn)定，因此正交試驗(yàn)選用的Mg2+濃度為2.25～3.00 mmol/L。

2.3 高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)結(jié)果分析

高丹草SRAP-PCR 正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3 可知，處理組合5、14、16 中擴(kuò)增電泳條帶數(shù)目最少（2～4 條）、多態(tài)性差、擴(kuò)增效果差；處理組合1、3、4、7、8、10、11、15 電泳條帶分布范圍小、數(shù)目較少、有缺條帶且背景較模糊；2、6、9、12、13 處理組合的電泳條帶數(shù)目多、多態(tài)性豐富、分布范圍廣（100～1 500 bp），且背景清晰、擴(kuò)增效果較好；對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行直觀分析和評(píng)定打分，確定處理組合13 為高丹草SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，具體為：275 μmol/L dNTP、3.0 ng/μL DNA、1.1 μmol/L 引物、1.00 U Taq DNA 聚合酶和2.25 mmol/L Mg2+，用ddH2O 補(bǔ)至20 μL。

圖3 高丹草SRAP-PCR 正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果

試驗(yàn)對(duì)5 個(gè)因素（3 次重復(fù)）水平進(jìn)行極差分析，k值表示在SRAP-PCR反應(yīng)體系中各因素同一水平下產(chǎn)生條帶數(shù)的平均值，其數(shù)值越大擴(kuò)增效果越好；R值是指高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系中同一因素在不同水平下的極差，即R值越大，對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響程度越大。高丹草SRAP-PCR 正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）表明，各因素對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響程度為：DNA 濃度＞Taq DNA 聚合酶用量＞dNTP 濃度＞引物濃度＞Mg2+濃度。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

2.4 高丹草SRAP-PCR優(yōu)化體系的驗(yàn)證

選用篩選出的SRAP-PCR 最佳體系對(duì)高丹草雙親和3 個(gè)單株基因組DNA 進(jìn)行體系擴(kuò)增重復(fù)驗(yàn)證。由圖4 可知，8 對(duì)SRAP 引物組合擴(kuò)增出的電泳條帶數(shù)目多、背景清晰無雜帶、分布范圍廣、多態(tài)性豐富且穩(wěn)定，證明該擴(kuò)增體系效果和重復(fù)性好、可靠性高，可用于高丹草SRAP-PCR 擴(kuò)增。

圖4 高丹草SRAP-PCR 的最佳體系驗(yàn)證

3 討論

篩選適宜的引物組合和穩(wěn)定擴(kuò)增效果清晰的SRAP-PCR反應(yīng)體系可用于SRAP 分子標(biāo)記多態(tài)性的研究[17-18]。單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有操作簡(jiǎn)便、均衡分散、可包含多種處理組合、整齊可比等優(yōu)點(diǎn)，能夠體現(xiàn)不同因素水平的相互影響[19]。

本試驗(yàn)結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系中5 個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選出高丹草最佳SRAP-PCR反應(yīng)體系。高丹草SRAP-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖的條帶數(shù)量和清晰度由于各因素對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響程度明顯不同，依次為DNA 濃度＞Taq DNA 聚合酶用量＞dNTP 濃度＞引物濃度＞Mg2+濃度。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)高丹草SRAP-PCR反應(yīng)體系影響最大的是模板DNA 濃度，其次為Taq DNA 聚合酶用量，Taq DNA 聚合酶作為PCR反應(yīng)的催化劑，可直接影響擴(kuò)增條帶的數(shù)目和清晰度。蘇輝等[20]研究表明，DNA 模板用量是優(yōu)化大豆SSR-PCR反應(yīng)體系的關(guān)鍵因素；于肖夏等[21]研究表明，dNTP 濃度對(duì)冰草屬SSR-PCR反應(yīng)體系影響最大；賈新平等[22]利用SSR-PCR反應(yīng)體系在二月蘭研究中得出，影響最大的是Taq DNA 聚合酶用量，其次為Mg2+濃度；戚華沙等[23]以海南油茶植物組DNA 為模板，進(jìn)行SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，結(jié)果表明，引物濃度對(duì)其擴(kuò)增效果影響最大，其次為dNTPs，并采用優(yōu)化后的體系進(jìn)行引物篩選獲得清晰穩(wěn)定和多態(tài)性豐富的32 對(duì)引物；梁芳瑜等[24]建立寬葉纈草的SRAP-PCR反應(yīng)體系，正交試驗(yàn)表明，影響其擴(kuò)增效果最大的為TaqMix 用量，其次為Taq DNA 聚合酶用量，退火溫度最優(yōu)為36.8 ℃，并采用該最優(yōu)體系篩選多態(tài)性豐富、條帶清晰穩(wěn)定的引物17 對(duì)。通過上述文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同的物種間，對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響因子有所差別。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出適合高丹草SRAP-PCR 的最佳反應(yīng)體系，總體積為20 μL，dNTP 濃度275 μmol/L、模板DNA 濃度3.0 ng/μL、引物濃度1.1 μmol/L、Taq DNA 聚合酶用量1.00 U 和Mg2+的濃度2.25 mmol/L，其擴(kuò)增出的電泳條帶數(shù)目多、背景清晰無雜帶、分布范圍廣，并用8 對(duì)SRAP 引物驗(yàn)證了該反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和可靠性，可為開展高丹草遺傳差異分析、新品種選育研究、遺傳作圖及相關(guān)性狀QTL 精細(xì)定位等研究奠定基礎(chǔ)。