楊江夏，霍 霞，盧雪玲，羅 瓊，陳梓涵，徐錫金，3

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)與發(fā)育毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；2．暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510632；3．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

脂氧素A4是通過(guò)跨細(xì)胞途徑，經(jīng)不同脂氧合酶按順序催化花生四烯酸而形成的一種內(nèi)源性抗炎介質(zhì)[1]。脂氧素A4通過(guò)與其受體結(jié)合傳遞炎癥消退信號(hào)，即促進(jìn)炎性細(xì)胞如外周血中性粒細(xì)胞的凋亡與清除，刺激單核細(xì)胞的非炎癥性趨化，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬活性，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)[2]。血漿脂氧素A4的表達(dá)水平受體內(nèi)炎癥狀態(tài)的影響，其變化是多種炎癥相關(guān)疾病發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[3]。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，生活在電子垃圾拆解區(qū)的兒童體內(nèi)多種環(huán)境化學(xué)污染物水平均高于參照組，如重金屬[4]、多環(huán)芳烴[5]等，且化學(xué)污染物暴露刺激兒童外周血中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞和IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子以及促炎介質(zhì)白三烯B4水平的增加[4,6]。這些促炎介質(zhì)的升高，可能激活體內(nèi)抗炎通路，啟動(dòng)體內(nèi)多種細(xì)胞和促炎癥消退介質(zhì)共同參與的抗炎程序。因此，本研究通過(guò)分析電子垃圾拆解區(qū)兒童血漿脂氧素A4水平的變化特點(diǎn)，探討環(huán)境化學(xué)污染物暴露對(duì)兒童免疫系統(tǒng)抗炎能力的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2018年11—12月，招募196名4～7歲兒童，平均年齡（5.43±0.64）歲。汕頭市貴嶼鎮(zhèn)（電子垃圾拆解區(qū)）兒童作為暴露組，其中男53名，女45名；汕頭市濠江區(qū)（無(wú)電子垃圾拆解活動(dòng)和污染的區(qū)域）兒童作為參照組，其中男55名，女43名。所有參與兒童樣本采集前1個(gè)月內(nèi)無(wú)外傷或感染性疾病。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有參與研究的兒童家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集和血漿脂氧素A4的檢測(cè)

由護(hù)士用EDTA抗凝管采集兒童空腹肘靜脈血2管，其中一管以1 500 r/min離心5 min，分離血漿，分裝后置-80℃冰箱保存；另一管運(yùn)送至檢驗(yàn)室使用Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex公司）分析外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)。血漿脂氧素A4的檢測(cè)：將100 μL完全解凍的血漿分裝樣本加入甲醇混合液（200 μL甲醇混合1.5 mL超純水），用1 mol/L的鹽酸將混合液pH酸化至3.5，得到樣本處理液。用2 mL甲醇和2 mL超純水預(yù)處理Sep-Pak C18 Plus Light濾芯（美國(guó)Waters公司）；將上述樣本處理液加入濾芯，然后用5 mL超純水和5 mL正己烷先后沖洗該濾芯，用2 mL甲酸甲酯洗脫出脂氧素A4，氮?dú)饬鲹]發(fā)甲酸甲酯，將殘留物溶解于1 mL稀釋過(guò)的提取物緩沖液中。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國(guó)Neogen公司）和Infinite M200 Pro光柵型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）檢測(cè)提取物緩沖液中的血漿脂氧素A4。樣本前處理、檢測(cè)流程、結(jié)果測(cè)定和計(jì)算嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的的計(jì)量數(shù)據(jù)以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行作圖。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

暴露組兒童血漿脂氧素A4水平[89.58（68.08，111.87）pg/mL]高于參照組兒童[80.04（61.05，97.30）pg/mL]（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。年齡分層分析發(fā)現(xiàn)，暴露組4歲～年齡段兒童血漿脂氧素A4水平[87.76（69.30，111.77）pg/mL]高于參照組4歲～年齡段兒童[67.49（55.05，84.91）pg/mL]（P＜0.05），見(jiàn)圖1B。血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，暴露組兒童外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)高于參照組兒童（P＜0.01），見(jiàn)表1。

圖1 參照組和暴露組兒童血漿脂氧素A4水平比較

表1 兩組兒童外周血炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（×109/L，±s，n=98）

表1 兩組兒童外周血炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（×109/L，±s，n=98）

1)與參照組相比，P＜0.01。

組別參照組暴露組白細(xì)胞6.84±1.82 7.10±1.53中性粒細(xì)胞3.24±1.52 3.36±1.31單核細(xì)胞0.37±0.12 0.45±0.151)

3 討論

炎癥是機(jī)體對(duì)有害刺激的免疫防御機(jī)制的一部分。炎癥的及時(shí)消退能有效防止炎癥慢性化和進(jìn)一步對(duì)機(jī)體造成的損傷。研究認(rèn)為，炎癥消退是一個(gè)依賴炎性滲出液中炎癥介質(zhì)改變的主動(dòng)和程序化進(jìn)程[7]。在炎癥過(guò)程中，炎性刺激物誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞快速響應(yīng)，內(nèi)流進(jìn)入炎癥發(fā)生部位，產(chǎn)生前列腺素、白三烯等炎性介質(zhì)，啟動(dòng)并放大炎癥信號(hào)；同時(shí)，前列腺素激活中性粒細(xì)胞中15-脂氧合酶的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)抗炎介質(zhì)（如脂氧素A4）的表達(dá)，啟動(dòng)抗炎信號(hào)[8-9]。脂氧素A4與脂氧素受體結(jié)合激活各種激酶，調(diào)控NF-κB等炎癥信號(hào)通路，抑制中性粒細(xì)胞的聚集和化學(xué)趨化、炎性細(xì)胞因子（IL-6、IL-8等）的表達(dá)，并通過(guò)刺激單核細(xì)胞的非炎癥性趨化和黏附、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞活性等發(fā)揮抗炎作用[10]。脂氧素水平的變化可能與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究顯示，與健康人群相比，非重癥哮喘患者脂氧素A4水平升高；但與非重癥哮喘患者相比，重癥哮喘患者脂氧素A4及其受體的基因和蛋白表達(dá)降低，脂氧素A4的合成障礙會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥和典型的氣道高反應(yīng)性，引起病情進(jìn)一步惡化[11]。因此，脂氧素A4水平變化與機(jī)體免疫系統(tǒng)抗炎能力的改變有著密切聯(lián)系。

汕頭市貴嶼鎮(zhèn)是一個(gè)有40多年電子垃圾處理歷史的地區(qū)。由于露天焚燒、酸洗等不規(guī)范電子垃圾拆解回收操作產(chǎn)生的環(huán)境污染物經(jīng)空氣、廢水、塵土傳播，使該區(qū)域受到大量重金屬[12]、多環(huán)芳烴[13-14]等有害化學(xué)污染物的嚴(yán)重污染。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的研究，2018年招募的長(zhǎng)期居住在貴嶼鎮(zhèn)的兒童體內(nèi)相比于參照組有更高濃度的多環(huán)芳烴[5]、鉛[6]等環(huán)境化學(xué)污染物，且本實(shí)驗(yàn)室前期研究均顯示，環(huán)境化學(xué)污染物刺激兒童外周血包括中性粒細(xì)胞、血小板、IL-6在內(nèi)多種炎癥介質(zhì)的升高[15]，表明這些兒童長(zhǎng)期處于低度炎癥的狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果顯示暴露組兒童血漿中脂氧素A4水平升高，表明電子垃圾拆解區(qū)的多種環(huán)境污染物刺激兒童免疫系統(tǒng)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體的抗炎保護(hù)機(jī)制，增加抗炎因子脂氧素A4的產(chǎn)生，促進(jìn)了炎癥的消退。暴露組4歲～年齡段兒童血漿脂氧素A4比參照組高，這與低年齡組更容易受到外界有害因素的干擾、刺激炎癥與抗炎反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)，且隨著年齡的增長(zhǎng)，兒童認(rèn)知能力的提高與手口習(xí)慣的改變減少了污染物暴露的機(jī)會(huì)。此外，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，暴露組兒童外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于參照組兒童[17]，而本研究顯示暴露組兒童外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于參照組，反映了脂氧素A4能夠減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并且刺激單核細(xì)胞非炎癥性趨化而促進(jìn)炎癥消退的生理作用，提示環(huán)境污染物的長(zhǎng)時(shí)間暴露刺激兒童免疫抗炎的積極應(yīng)答。

綜上所述，在電子垃圾拆解區(qū)的環(huán)境化學(xué)污染物暴露下，兒童機(jī)體內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)，并啟動(dòng)自身抗炎機(jī)制，使機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但長(zhǎng)期持續(xù)的污染物暴露，使機(jī)體一直處于炎癥與抗炎的對(duì)抗?fàn)顟B(tài)，超負(fù)荷消耗兒童免疫系統(tǒng)的抗炎介質(zhì)，不利于兒童的健康生長(zhǎng)。因此，本研究為進(jìn)一步探討長(zhǎng)期環(huán)境化學(xué)污染物暴露對(duì)體內(nèi)免疫抗炎能力的影響提供了基礎(chǔ)。