李奕莛，劉璐，趙軍英，喬為倉，陳君，劉彥品，侯俊財，陳歷俊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學 食品學院，哈爾濱 150030；2.北京三元食品股份有限公司 國家母嬰乳品健康工程技術研究中心北京市乳品工程技術研究中心母乳研究技術創(chuàng)新中心，北京 100163）

0 引言

膽固醇是參與人體生長代謝活動中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，但血清中膽固醇水平過高也會造成負面影響，研究表明血清膽固醇水平過高容易發(fā)生全身動脈粥樣硬化，從而導致心臟病，腦梗死等疾病[1]。隨著生活水平的提高，我國居民血清總膽固醇水平呈直線上升，2015年中國成年人血脂異?；疾÷蕿?7.5%，其中高膽固醇血癥患病率高達9.6%，高膽固醇疾病嚴重影響了我國居民的身體健康[2]。

目前對于膽固醇疾病的最主要的治療方式為藥物治療，但藥物治療存在成本高、副作用大、治療周期長等弊端；此外還可以進行飲食干預，但飲食干預不好控制，對患者自控能力要求嚴格；應用乳酸菌來降低血清膽固醇成為當前的研究熱點。近年來眾多研究表明，當患者的血清膽固醇含量下降后，誘發(fā)其他疾病的可能性也顯著降低[3]，許多動物及臨床實驗也證明了通過乳酸菌來降解膽固醇是一種可行的方式[4-5]。腸道中的乳酸菌，對維持腸道微生態(tài)以及提高免疫能力有重要作用，因此通過乳酸菌來治療和預防膽固醇及心血管疾病是未來的有效途徑[6]。

人體腸道環(huán)境中含有豐富多樣的人源益生菌群，相較外源乳酸菌，人源乳酸菌能夠更好的適應人體胃腸道環(huán)境，且有研究表明人源乳酸菌能夠更好的定植于腸道環(huán)境，并與其他菌群發(fā)揮協(xié)同作用使菌株的益生效果更加顯著[7]。同時，人源乳酸菌為人體固有益生菌，能夠有效避免因外源乳酸菌攝入而導致的腸道菌群失衡，是一種潛在的更為安全有效的治療和預防高膽固醇疾病的益生菌[8-9]。因此，本研究旨在從28株人源乳酸菌中篩選具有降膽固醇能力、特性良好的人源乳酸菌，為開發(fā)治療和預防高膽固醇疾病的產(chǎn)品提供技術理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株樣本，保存于北京三元食品股份有限公司母嬰研究中心；鄰苯二甲醛、膽固醇，國藥集團化學試劑有限公司；牛膽鹽，北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術股份有限公司；PBS磷酸緩沖液、?；敲撗跄懰徕c，北京索萊寶科技有限公司；冰醋酸、鹽酸和硫酸等均為分析純，羅恩試劑。

1.2 儀器與設備

全自動高壓滅菌鍋，湖北永大換熱設備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；冷凍離心機，德國SIGMA公司；超凈工作臺，藝斯高貿(mào)易有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

從-80℃冰箱中取出甘油保存的菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，一代菌液按1∶1的比例保存至滅菌后的30%甘油-80℃進行保存，試驗所用菌株菌活化三代后使用。

1.3.2 降解膽固醇菌株的初篩

采用鄰苯二甲醛法測定培養(yǎng)基中的膽固醇含量。取膽固醇含量為0.2 g/L培養(yǎng)基0.2 mL，鄰苯二甲醛工作液0.2 mL，冰醋酸2.6 mL，濃硫酸2.0 mL，混勻均勻后，室溫下靜置15 min，于550 nm處測定吸光度[10]。實驗測定鄰苯二甲醛標準曲線為y=17.32x-0.0043 R2=0.9983。

式中：N1-膽固醇總含量；N0-上清液中膽固醇含量。

1.3.3 膽固醇同化量、沉淀量試驗

（1）沉淀量試驗。

將乳酸菌發(fā)酵液于4℃下12 000 g離心10 min，得到沉淀，將沉淀用pH值7的磷酸鈉緩沖液洗滌2次，同一條件離心，得到的上清液即為沉淀洗液，計算公式如下：

式中：B為沉淀率；C總為總膽固醇含量；C沉為PBS洗脫液中膽固醇含量。

（2）同化量試驗。

膽固醇在發(fā)酵過程中減少，并且沒有在沉淀中出現(xiàn)的部分為膽固醇同化量，結(jié)果計算如下：

式中：A為同化率；C總為總膽固醇含量；C上為上清液中膽固醇含量；C沉為PBS洗脫液中膽固醇含量。

1.3.4 膽鹽水解酶定性試驗

將乳酸菌在含有5 mg/L牛磺脫氧膽酸鈉鹽和0.37 g/L氯化鈣的MRS固體培養(yǎng)基中厭氧條件下37℃培養(yǎng)72 h。以菌落產(chǎn)生的不透明暈圈或不透明顆粒狀白色菌落特征表示膽鹽水解酶活性[11]。

1.3.5 特性試驗

耐酸試驗：無菌條件下將活化并富集3次后的乳酸菌菌株稀釋至108CFU/mL，離心后去除上清液，用PBS緩沖液洗滌3次后分別置于pH 1.5、pH 2.0、pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，分別在0、1、3 h取樣并用PBS緩沖液梯度稀釋后取100μL涂布于MRS平板，每個稀釋度3個平行，37℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)[12]。

耐膽鹽試驗：步驟同耐酸試驗，洗滌后置于含有0.3%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中。

2 結(jié)果與分析

2.1 28株人源乳酸菌膽固醇總降解能力的初步篩選

本試驗對菌庫中現(xiàn)有的28株人源乳酸菌進行活化后通過鄰苯二甲醛法對其進行膽固醇降解率進行初步測定，其中母乳來源的菌株23株，嬰兒糞便來源的菌株5株。

膽固醇降解結(jié)果如圖1所示，共有13株乳酸菌降解率達到了20%以上，其中格氏乳桿菌F020、F024降解率最高，且均為嬰兒糞便來源，降解率高達31.62%、31.11%。同時，來自母乳的B1-26至B1-30菌株的膽固醇降解率也較好，均為25%左右，降解率最低的菌株為來自嬰兒糞便的格氏乳桿菌F002，降解率僅有2.61%，其次是來自母乳的植物乳桿菌R9（4.13%）；陳怡婷與吳慧昊等人進行的乳酸菌降解膽固醇實驗中，菌株最高降解率也在30%~35%之間[13-14]，因此本實驗測得乳酸菌具有較高的降解能力。根據(jù)試驗結(jié)果最終選擇了降解率高的前6株乳酸菌作為后續(xù)試驗菌株。

圖1 28株人源乳酸菌膽固醇降解率

2.2 6株膽固醇降解能力較強的人源乳酸菌的膽固醇同化量、沉淀量的測定

乳酸菌在含有游離膽鹽的培養(yǎng)基中可以發(fā)生共沉淀作用，膽鹽水解酶（Bile Salt Hydrolase，BSH）可以特異性結(jié)合含有酰胺鍵的膽汁酸，釋放出游離的膽汁酸與牛磺酸、甘氨酸參與膽固醇的代謝從而降解膽固醇；此外，乳酸菌可以通過同化作用降解膽固醇，還可以通過細胞壁對膽固醇進行吸附以及細胞質(zhì)膜對膽固醇進行吸收[15]。

如圖2所示，沉淀作用最強的為格氏乳桿菌F020，沉淀率10.49%；同化作用最強的為格氏乳桿菌F024，同化率25.93%，但格氏乳桿菌F024沉淀率最低為5.19%，格氏乳桿菌B1-29的同化率最低，比格氏乳桿菌F024少10.01%；由此可以看出總降解率較高的格氏乳桿菌F020、F024其沉淀作用與同化作用也相對較高，具有良好的膽固醇降解能力。

圖2 6株人源乳酸菌膽固醇沉淀量與同化量

2.3 6株膽固醇降解能力較強的人源乳酸菌的膽鹽水解酶定性分析

6株乳酸菌在添加?；敲撗跄懰徕c的培養(yǎng)基中均產(chǎn)生不透明的白色菌落沉淀圈，如圖3所示，因此6株乳酸菌均具有膽鹽水解酶活性，這是由于在試驗中，被生物酸化的培養(yǎng)基出現(xiàn)解共軛作用形成的游離膽汁酸質(zhì)子化引起的[16]。其中格氏乳桿菌B1-26的沉淀圈最小直徑為8.07 mm，羅伊氏乳桿菌B1-28產(chǎn)生的沉淀圈最大為11.27 mm，其他4株乳酸菌沉淀圈在9.87~10.31mm之間，因此羅伊氏乳桿菌B1-28的BSH活性最高。研究發(fā)現(xiàn)清除膽固醇的主要機制與細胞的BSH活性有關[17]，通過解共軛膽鹽釋放未共軛的膽汁酸，誘導膽固醇的沉淀。

圖3 6株人源乳酸菌膽鹽水解酶定性

綜合6株人源乳酸菌體外降解膽固醇的試驗結(jié)果，分別選取總降解率最高的格氏乳桿菌F020，同化量最高的格氏乳桿菌F024，膽鹽水解酶活性最強的羅伊氏乳桿菌B1-28進行耐酸耐膽鹽特性試驗。

2.4 3株膽固醇降解能力較強的人源乳酸菌的耐酸試驗

人體在進食后會分泌大量胃酸使胃內(nèi)pH值下降至2-3左右，從而更有利于消化酶消化食物，而乳酸菌只有在低pH的條件下存活才能進入人體腸道發(fā)揮作用[18]。因此對上述3株人源乳酸菌進行酸性環(huán)境的耐受性試驗，分別選取了pH 1.5、2.0、3.0三個梯度，研究乳酸菌在1 h與3 h的活菌數(shù)及存活率。

如圖4所示，在pH為1.5的條件下格氏乳桿菌F020、F024的活菌數(shù)菌均小于104CFU/mL存活率小于0.1%，因此格氏乳桿菌對該濃度的酸性條件不耐受；而格氏乳桿菌F020在pH為2.0與3.0件下的活菌數(shù)一直在增加，并且都大于100%，而格氏乳桿菌F024在該條件下存活率較低，pH 2.0條件下3 h后菌株的存活率降到了1.03%，pH 3.0時存活率僅有34.38%，總體存活率較低；羅伊氏乳桿菌B1-28在3個濃度的酸性條件下1 h存活率都不足10%，3 h均低于25%。綜合上述結(jié)果，F(xiàn)020的對酸性條件的耐受性最好。

圖4 3株人源乳酸菌在不同酸性條件下的耐受性

2.5 3株膽固醇降解能力較強的人源乳酸菌的耐膽鹽試驗

經(jīng)過胃消化吸收后的乳酸菌進入小腸，小腸中膽鹽會影響乳酸菌生長繁殖，因此，對膽鹽耐受性良好的乳酸菌是在腸道中存活、定植，發(fā)揮益生作用的前提[19]。本試驗在培養(yǎng)基中添加0.3%膽鹽，研究乳酸菌在1 h與3 h的活菌數(shù)及存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 3株人源乳酸菌在0.3%膽鹽條件下的耐受性

在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h羅伊氏乳桿菌B1-28對膽鹽的耐受性最好，達到了82.98%，但在3 h時格氏乳桿菌F020的耐受性最好，達到了102.94%，而B1-28的存活率則降低到了74.47%，格氏乳桿菌F024在0.3%膽鹽濃度下的活菌數(shù)降低到了104CFU/mL，存活率不足0.1%，對膽鹽的耐受性最差；由此可以看出在0.3%的膽鹽濃度下，格氏乳桿菌F020的耐受性最好，可在0.3%膽鹽濃度下生長繁殖。

3 結(jié)果與討論

本研究以人源乳酸菌為研究對象，篩選出具有膽固醇降解能力并且特性良好的人源乳酸菌。實驗結(jié)果表明本菌庫中人源乳酸菌降解率最高達到了31.62%，而陳怡婷的研究得到從發(fā)酵食品中得到的乳酸菌膽固醇降解率為35.33%[13]，表明本研究中的人源乳酸菌具有良好的膽固醇降解能力并且相對于外源乳酸菌，有良好的人體環(huán)境的適應能力，更有利于定植在腸道中發(fā)揮作用。膽固醇降解能力高的乳酸菌同時具有較高的能力的沉淀作用，乳酸菌對膽固醇的降解與細胞的膽鹽水解酶活性有重要關系，通過解共軛膽鹽釋放未共軛的膽汁酸，誘導膽固醇的沉淀[20]；本實驗6株乳酸菌雖都具有膽鹽水解酶活性，但對于膽固醇的降解能力并不相同，這是由于膽鹽水解酶受不同基因的調(diào)控，所以不同種屬間具有較大差異，即使相同種屬下，乳酸菌的膽固醇降解能力也不相同[21]。乳酸菌可以耐受腸道環(huán)境在腸道中定植是發(fā)揮乳酸菌功能性的先決條件。格氏乳桿菌F020的耐受性最好，可以在低pH和高膽鹽條件下進行生長繁殖。陳大衛(wèi)等人也研究發(fā)現(xiàn)具有膽固醇降解能力的人源乳酸菌同時具有較好的耐酸耐膽鹽能力[22]。由于消費者對健康生活方式的渴望以及對來自天然來源的具有增強營養(yǎng)和治療價值的食品的需求增加，食品行業(yè)對所謂的功能性食品表現(xiàn)出越來越大的興趣。Sahoo等人將從本地乳制品中篩選出的高膽固醇降解能力乳酸菌加入調(diào)制乳中進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)對小鼠的血清膽固醇具有明顯的改善[23]。綜上，本研究篩選出格氏乳桿菌F020膽固醇降解能力良好，對酸性及膽鹽環(huán)境耐受性強，具有潛在的應用價值。