何靜怡，楊梅，林佳，梁安文，李廣宏，王方海

有害生物控制與資源利用國家重點實驗室/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

水稻是我國重要糧食作物，而白背飛虱是危害水稻的主要害蟲之一。白背飛虱（Sogatella furcifera）屬昆蟲綱（Insecta），半翅目（Hemiptera），飛虱科（Delphacidae）［1］。雄性成蟲黑褐色，雌性成蟲黃褐色，因其前胸背板和中胸背板呈白色而得名［2］。白背飛虱生活周期包括卵期、若蟲期和成蟲期，成蟲有長翅和短翅兩種翅型［3］。長翅型成蟲擅長遷飛，可以逃避惡劣的環(huán)境；短翅型雌蟲多為留居型，具有較高的繁殖力，其產(chǎn)卵量是長翅雌蟲的2～4倍［4］。長、短翅型的比例是預(yù)測飛虱危害的重要參數(shù)［5-6］。

表觀遺傳是在基因組DNA 沒有改變的前提下，通過化學(xué)修飾影響基因表達(dá)，從而造成表型變化，可以穩(wěn)定遺傳給后代。表觀遺傳參與生物體多種重要的生命活動，也是生物體應(yīng)對外界脅迫和環(huán)境變化的重要機制［7］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs，DNA methyltransferases）的催化下，給DNA 添加甲基修飾的過程，是一種重要的表觀遺傳修飾［8］。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可將DNMTs 分為DNMT1、DNMT2 和DNMT3。DNMT1主要負(fù)責(zé)在半保留復(fù)制中，以親代甲基化位點為模板，催化子鏈甲基化。雖然傳統(tǒng)概念認(rèn)為DNMT1只有維持甲基化功能，但近年來研究表明，DNMT1 在DNA 從頭甲基化中同樣起著非常重要的作用［9-10］。DNMT2 主要催化tRNA 甲基化，但不具備催化CpG 島甲基化的特性［11］。DNMT3 是從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在細(xì)胞分裂初期催化未甲基化的DNA生成新的甲基化位點［12］。

在昆蟲中，通常都存在DNMT1 和DNMT2；而DNMT3 僅在少數(shù)昆蟲（如膜翅目昆蟲） 中被發(fā)現(xiàn)［12-13］。

我們研究發(fā)現(xiàn)，飛虱雌性和雄性成蟲體內(nèi)的基因組甲基化式樣和水平存在明顯差異，同時發(fā)現(xiàn)在不同翅型個體中的基因組甲基化式樣和水平也存在明顯差異［14-17］。而DNMT1 是導(dǎo)致基因組甲基化式樣和水平發(fā)生變化的關(guān)鍵因子之一，故DNMT1 基因在白背飛虱性二型和翅二型分化過程中應(yīng)發(fā)揮著一定的調(diào)控作用。

本研究通過建立白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，結(jié)合已經(jīng)公開發(fā)表的白背飛虱基因組數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)的方法首先重點闡明白背飛虱DNMT1基因的結(jié)構(gòu)特點，然后利用熒光定量PCR 具體測定了DNMT1 基因在雌雄成蟲個體中的頭、胸、腹等部位的表達(dá)。該研究將增進(jìn)對稻飛虱DNMTs 的具體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的認(rèn)識，并為探索新的防治稻飛虱的方法或途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白背飛虱采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田，在實驗室已連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件：溫度（28±2）℃、相對濕度70%、光周期為16 h 光照：8 h 黑暗。選取羽化后24 h 內(nèi)的雌雄成蟲各10 頭，冷凍后用刀片將蟲體頭、胸、腹3 部分分離，并分別收集頭、胸、腹3部分作為待檢測樣品。

本實驗室已測得白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。根據(jù)注釋，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到包含有白背飛虱DNMT1 基因的序列片段，序列號為c88319.graph_c0，片段長度為4 524 bp。GenBank 登錄號為MW291509。白背飛虱基因組序列來自NCBI 的Genome數(shù)據(jù)庫（ID 18187）。

1.2 開放閱讀框分析

使用NCBI 的ORFfinder （https：//www. ncbi.nlm. nih. gov/orffinder/）對白背飛虱DNMT1 基因的開放閱讀框序列進(jìn)行分析。

1.3 同源序列驗證

使用NCBI 的在線BLAST 工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行白背飛虱DNMT1的同源序列尋找，并使用DNAMAN 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹的物種序列信息均來自NCBI。

1.4 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

使用NCBI 的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對白背飛虱DNMT1基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.5 外顯子和內(nèi)含子的分布

將白背飛虱DNMT1 基因的開放閱讀框與白背飛虱全基因組序列進(jìn)行比對分析。能比對上的序列是白背飛虱DNMT1 基因的外顯子，位于外顯子中間的非編碼基因序列則是白背飛虱DNMT1 基因的內(nèi)含子。

1.6 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

在ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam.html）上對白背飛虱DNMT1 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.7 蛋白糖基化位點分析

應(yīng)用NetNGlyc （http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/）軟件分析蛋白N 型糖基化位點。應(yīng)用YinOYang （http：//www. cbs. dtu. dk/services/YinOYang/）軟件分析蛋白O型糖基化位點。

1.8 實時熒光定量PCR

首先用Trizol（Invitrogen，美國）抽提法從白背飛虱各樣品中提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix（TaKaRa，日本）的操作說明將得到的總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，接著使用軟件Primer Premier 6.0 設(shè)計出DNMT1 基因的引物為（F：ACGCCCAAGACGACAACT；R：CATGACAATGCCGACCAG）。內(nèi)參基因為Alpha 1-tubulin（NCBI 登錄號為KP735521），qRT-PCR 實驗采用SYBR green 法，3 次重復(fù)。實驗結(jié)果使用2-△△Ct法進(jìn)行處理，SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白背飛虱DNMT1基因的開放閱讀框分析

對包含白背飛虱DNMT1 基因的測序片段c88319. graph_c0 進(jìn)行開放閱讀框在線分析。結(jié)果表明，位于序列首端的ATG 和序列尾端的TGA 組成了最大的開放閱讀框（圖1）。說明c88319.graph_c0 的全長即為白背飛虱DNMT1 基因的開放閱讀框，長度為4 524 bp，編碼由1 507 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

圖1 轉(zhuǎn)錄組片段c88319.graph_c0的開放閱讀框Fig.1 The open reading frame of c88319.graph_c0

2.2 同源序列驗證

將白背飛虱DNMT1 基因的開放閱讀框序列通過NCBI 的在線BLAST 進(jìn)行同源序列尋找，發(fā)現(xiàn)該序列與多種生物的DNMT1 基因高度同源，和褐飛虱的同源性最大。這進(jìn)一步驗證了我們所獲得的白背飛虱DNMT1基因的開放閱讀框序列是正確的。

利用NCBI 獲取不同昆蟲的DNMT1 蛋白序列（表1），用DNAMAN 進(jìn)行同源度分析，白背飛虱與褐飛虱（Nilaparvata lugens）、茶翅蝽（Halyomorpha halys）、意大利蜜蜂（Apis mellifera）、收獲蟻（Pogonomyrmex barbatus）、紅火蟻（Solenopsis invicta）、小菜蛾（Plutella xylostella）、家蠶（Bombyx mori）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的蛋白序列同源度分別為83.65%、53.02%、50.56%、46.35%、46.12%、42.96%、42.72%、35.67%和28.75%。將以上不同物種構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2），從圖2 中可以看到DNMT1 在各種昆蟲之間高度保守，白背飛虱的DNMT1 和褐飛虱的親緣關(guān)系最近，并與同為半翅目的茶翅蝽聚為一支，但與鱗翅目和鞘翅目的親緣關(guān)系則相對較遠(yuǎn)。

圖2 白背飛虱DNMT1系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of DNMT1 of Sogatella furcifera and other homologous sequences from insects

表1 不同物種DNMT1的氨基酸登錄號Table 1 Amino acid accession numbers of DNMT1 in different species

2.3 保守結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI 的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫對白背飛虱DNMT1 基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果如圖3 所示，白背飛虱DNMT1的結(jié)構(gòu)具有典型的DNMT1特征，包括一個DNMT1 相關(guān)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DMAP binding domain）、一個復(fù)制灶靶向序列（RFTs，replication foci targeting sequence）、一個富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)域（CXXC zinc finger domain）、聚溴同源結(jié)構(gòu)域（PBHD，polybromo homology domain）和一個催化結(jié)構(gòu)域（dcm domain）。

圖3 白背飛虱DNMT1的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domains of DNMT1 gene of Sogatella furcifera

2.4 外顯子和內(nèi)含子的分布

將白背飛虱DNMT1 基因的開放閱讀框與白背飛虱全基因組序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)白背飛虱DNMT1 基因位于白背飛虱第3 號染色體上。白背飛虱3 號染色體（CM025292.1）全長67 498 134 bp，而白背飛虱DNMT1 基因位于3 號染色體的第53 720 184 ～ 53 742 750 bp 處（圖4），是斷裂基因，被許多非編碼區(qū)域序列隔開，基因全長為22 567 bp，含有18 個外顯子（長度分別為55、156、140、351、226、123、249、200、141、194、141、465、214、78、92、139、236、1 696 bp）和17 個內(nèi)含子（長度分別為73、2833、642、508、631、443、675、805、122、805、1 179、1 608、343、711、2 977、613、2 043 bp）（圖5）。外顯子在圖中用阿拉伯?dāng)?shù)字1～18標(biāo)注，內(nèi)含子在圖中用大寫字母A～Q標(biāo)注。

圖4 DNMT1基因在白背飛虱3號染色體上的位置Fig.4 The location of DNMT1 gene on chromosome 3 of Sogatella furcifera

圖5 白背飛虱DNMT1基因的外顯子和內(nèi)含子分布Fig.5 Exons and introns of DNMT1 gene of Sogatella furcifera

2.5 白背飛虱DNMT1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

白 背 飛 虱 DNMT1 蛋 白 分 子 式 為C7466H11720N2098O2317S82，相對分子質(zhì)量為170 572.77，其中絲氨酸含量最高，占序列的7.8%。蛋白理論等電點為6.15，屬于負(fù)電性的酸類有212個，陽性堿類的有196個，所以蛋白基本上可以被認(rèn)為是酸類蛋白。其網(wǎng)織紅細(xì)胞存在時間大約幾十小時。

2.6 DNMT1在雌雄成蟲中的表達(dá)

我們分別檢測了DNMT1 在雌雄成蟲身體各部位的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNMT1 主要在腹部表達(dá)，其次胸部、頭部表達(dá)量很低。同時發(fā)現(xiàn)雌蟲中的整體表達(dá)量明顯高于雄蟲，高達(dá)4.3倍（圖6）。

圖6 DNMT1在白背飛虱雌雄成蟲中的表達(dá)Fig.6 DNMT1 expression in male and female adults

3 討 論

本文通過在白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到白背飛虱DNMT1 的cDNA 序列，并通過NCBI 的ORF finder 網(wǎng)站對序列進(jìn)行開放閱讀框在線分析，得到了全長4 524 bp的開放閱讀框序列，該序列編碼由1 507個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有DNMT1的典型結(jié)構(gòu)：位于N端的DNMT相關(guān)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，復(fù)制灶靶向序列，富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)域，聚溴同源結(jié)構(gòu)域，以及位于C端的催化結(jié)構(gòu)域。再將開放閱讀框序列同白背飛虱全基因組序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)DNMT1 基因位于白背飛虱第3 號染色體上，長度為22 567 bp，含有18 個外顯子和17 個內(nèi)含子。這是首次有關(guān)白背飛虱DNMT1 基因結(jié)構(gòu)的詳細(xì)報道，為該基因進(jìn)一步的體外表達(dá)和功能研究打下了基礎(chǔ)，有利于探索該酶在稻飛虱生長發(fā)育中的具體調(diào)控作用，豐富昆蟲DNA 甲基化現(xiàn)象的研究。

已經(jīng)觀察到昆蟲與人類DNMT1 基因存在C 端結(jié)構(gòu)保守、N端結(jié)構(gòu)不同的特點［18-19］，比如家蠶和蜜蜂DNMT1缺乏DMAP1結(jié)合位點、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA，proliferating cell nuclear antigen）結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核定位序列，金小蜂DNMT1c以及豌豆蚜的DNMT1a 和DNMT1b 中缺少鋅離子結(jié)合域［12-13］。我們對于白背飛虱DNMT1 基因的研究也證明了這一結(jié)論，與人類DNMT1相比，白背飛虱DNMT1缺乏PCNA 結(jié)合位點和核定位序列，說明DNMT1 在昆蟲中的作用模式可能與人類中的作用模式有所不同。

DNMT1 在雌成蟲中的整體表達(dá)量明顯高于雄成蟲，達(dá)4.3 倍，推測雌成蟲的基因組DNA 甲基化率應(yīng)該高于雄成蟲。而之前的全基因組的DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)白背飛虱雌成蟲的全甲基化率（fully-methylated ratio）為7.64%，高于雄成蟲的6.88%［16］，與我們的分析結(jié)果基本一致。