張真豪，袁夢(mèng)儀，付博凡，高玉平，肖龍菲，倪和民，郭凱軍，蘇 月，安 紅，王相國(guó)*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 北京市昌平區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102206；3.天津市薊州區(qū)下倉(cāng)鎮(zhèn)人民政府，天津 301905)

在不同生物體和組織器官中，低氧應(yīng)答結(jié)果對(duì)機(jī)體的影響具有兩面性[1]。由于妊娠初期滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)程度淺，胚胎與母體之間物質(zhì)交流建立不完整，螺旋動(dòng)脈尚未重塑，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞未完成轉(zhuǎn)化而形成完整的血管系統(tǒng)，使該階段胎盤(pán)組織處于相對(duì)低氧環(huán)境中[2-4]。

以往關(guān)于低氧對(duì)人和小鼠的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞影響的研究表明，滋養(yǎng)層細(xì)胞功能受PLGF調(diào)節(jié)。PLGF作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子之一，能促進(jìn)血管生成并調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[5]，但其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)控作用受滋養(yǎng)層細(xì)胞局部微環(huán)境影響[6]。PLGF缺失或抑制雖然能減少新血管產(chǎn)生，但不影響血管的發(fā)育[7]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLGF通過(guò)作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其遷移與增殖[8]。研究證實(shí)，PLGF能使內(nèi)皮細(xì)胞中DNA合成顯著上升，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活[9]。在早孕期，胎盤(pán)絨毛內(nèi)合體滋養(yǎng)細(xì)胞中的PLGFmRNA表達(dá)較強(qiáng)，但在孕晚期胎盤(pán)血管合體膜中的PLGFmRNA表達(dá)最豐富[7]。為了調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能、增強(qiáng)胎盤(pán)血氧供給，滋養(yǎng)層細(xì)胞合成大量PLGF[10,11]。目前，低氧對(duì)人類(lèi)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響已有相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于低氧對(duì)奶牛胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞影響還少見(jiàn)報(bào)道。就此系統(tǒng)研究了低氧狀態(tài)對(duì)奶牛胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞造成的一系列影響，旨在為奶牛胎盤(pán)發(fā)育研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞：奶牛胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系(hTERT-BTC)由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物育種與輔助生殖團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建[12]并保存。

胎牛血清：杭州四季青公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA KIT、熒光定量試劑盒SYBR均為日本Toyobo公司。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒：北京Leagene公司。DMEM/F12培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司。兔抗人hTERT單克隆抗體和兔抗人E-Cahderin單克隆抗體為美國(guó)Abcam公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000為美國(guó)Invitrogen公司。引物合成：上海生工公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱314819-1280美國(guó)Thermo公司，熒光定量PCR儀G8830A美國(guó)ABI公司，凝膠成像儀721BR09549美國(guó)AlphaInotech公司，B2型生物安全柜BCM-1300A蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，高速臺(tái)式低溫離心機(jī)ALLEGRA-64R德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 建立CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞低氧模型

將奶牛胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，加入0、50、100、150、200、250 μg/mL的CoCl2篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)基每3 d更換1次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，重復(fù)3次。利用Western Blot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)情況。

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PLGFmRNA表達(dá)量 利用Trizol法提取常氧組(0 μg/mL CoCl2)、低氧組(200 μg/mL CoCl2)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系中RNA，每組3個(gè)重復(fù)，反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板，交由上海生工設(shè)計(jì)引物。表1是引物序列。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

PCR擴(kuò)增體系為：10×buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，MgCl21.5 μL，TapDNA聚合酶0.25 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，ddH2O 14.75 μL，cDNA 1 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，按95 ℃下反應(yīng)30 s、56 ℃下反應(yīng)30 s、72 ℃下反應(yīng)60 s循環(huán)反應(yīng)30次，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2 顯微鏡觀察 胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞鋪滿六孔板后，設(shè)置常氧組(0 μg/mL CoCl2)、低氧組(200 μg/mL CoCl2)各3個(gè)孔，均處理24 h后，用10 μL槍頭按照標(biāo)記線做劃痕，每個(gè)孔3條劃痕，用PBS沖洗，4%多聚甲醛孵育固定10 min，固定后用PBS清洗2次，用結(jié)晶紫染色液染色10 min，用PBS緩沖液清洗殘留染色液，置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取6個(gè)鏡下視野，拍照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

按3∶1的比例將Matrigel基底膠(培養(yǎng)基與槍頭用4 ℃預(yù)冷處理)與不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋處理，在Transwell小室濾膜中按50 μL/孔的劑量加入Matrigel基底膠，在37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫孵育30 min，收集2×104個(gè)經(jīng)200 μg/mL CoCl2處理24 h的奶牛胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞，將Transwell上室用Matrigel包被，加入200 μL無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后的細(xì)胞，在下室中加入500 μL的DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，放入含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，將濾膜上方的上室內(nèi)的細(xì)胞和基質(zhì)膠用棉簽輕輕擦去，再用PBS緩沖液沖洗干凈，用4%多聚甲醛將小室包裹孵育，固定穿過(guò)濾膜的細(xì)胞10 min，用PBS緩沖液清洗2次，用結(jié)晶紫染色液染色10 min，再用PBS緩沖液清洗殘留染色液，干燥后將小室濾膜下室面朝上，置于顯微鏡下觀察，鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，拍照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western Blot檢測(cè) 將低氧處理細(xì)胞和未處理細(xì)胞(作為陽(yáng)性對(duì)照)中的總蛋白分別提取出來(lái)。采用BCA法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度。制備SDS-PAGE膠(由12%分離膠和5%濃縮膠組成)，將膠板放入電泳槽內(nèi)，浸泡于電泳液中；在點(diǎn)樣孔內(nèi)加入蛋白Marker與蛋白樣品，接通電源并設(shè)置80 V電壓電泳20 min后轉(zhuǎn)為100 V電壓繼續(xù)電泳45 min；觀察蛋白Marker達(dá)到分離要求后，將膠板取出浸泡于轉(zhuǎn)膜液中，在轉(zhuǎn)膜液中切下大小合適含有目的條帶的膠條并按照正極板、海綿墊、濾紙、PVDF膜、膠、濾紙、海綿墊和負(fù)極板的順序放置轉(zhuǎn)膜夾，在電泳槽內(nèi)加入預(yù)冷好的轉(zhuǎn)膜液與冰盒，放入轉(zhuǎn)膜夾，將電泳槽放入盛有冰塊的盆中，100 V電壓轉(zhuǎn)膜75 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束之后，室溫下將轉(zhuǎn)好的PVDF膜放入5%脫脂奶粉內(nèi)，于搖床上緩慢搖動(dòng)封閉1～2 h；用5%脫脂奶粉配制E-Cadherin抗體(一抗)，將封閉結(jié)束后的PVDF膜放入一抗內(nèi)并放在4 ℃冰箱內(nèi)孵育，過(guò)夜；一抗孵育結(jié)束后用含0.1% Tween20的PBS緩沖液洗滌5次，每次15 min；然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的二抗中于搖床上室溫孵育1～2 h；二抗孵育完畢后，將PVDF膜用PBST緩沖液洗滌5次，即可滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑混合液，進(jìn)行暗室X-射線膠片顯影。

采用SPSS 18.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)方法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05視為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適CoCl2濃度

HIF-1α是細(xì)胞在低氧條件下出現(xiàn)的低氧應(yīng)答蛋白，其含量會(huì)隨氧分壓變化而變化，以此作為篩選依據(jù)。圖1 顯示，不同濃度的CoCl2誘導(dǎo)表達(dá)的HIF-1α量不同，呈現(xiàn)出隨著CoCl2濃度的升高而顯著升高的趨勢(shì)(P<0.05)。因此，以CoCl2濃度為200 μg/mL作為后續(xù)建立模型的濃度。

M:蛋白Marker; 1～5: 0、100、150、200、250 μg/mL CoCl2M: Protein Marker; 1-5: 0, 100, 150, 200, 250 μg/mL CoCl2圖1 不同CoCl2濃度下HIF-1α的表達(dá)情況Fig.1 The expression of HIF-1α under different concentrations of CoCl2

2.2 低氧對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)、遷移及浸潤(rùn)的影響

圖2顯示，常氧環(huán)境下的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞分布均勻且密集，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能夠清楚地觀察到細(xì)胞偽足及合胞體。低氧環(huán)境下的滋養(yǎng)層細(xì)胞密度下降，數(shù)量明顯減少，滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖緩慢，偽足數(shù)量減少，同時(shí)合胞體數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不同的改變。

圖2 低氧條件下滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)、遷移及浸潤(rùn)變化情況Fig.2 Changes in trophoblast morphology, migration and infiltration of trophoblast cells under hypoxia

常氧狀態(tài)下的滋養(yǎng)層細(xì)胞在遷移過(guò)程中分布均勻，遷移細(xì)胞狀態(tài)良好；但在低氧環(huán)境下的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的遷移減緩，遷移率下降，分布不均勻并且有明顯的空白區(qū)域。

常氧狀態(tài)下的滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)能力強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量多，密度大，細(xì)胞形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好。低氧環(huán)境下的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞在Transwell小室中穿梭數(shù)量減少，表現(xiàn)出明顯的浸潤(rùn)率下降。

2.3 低氧條件下PLGF mRNA表達(dá)

胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)作為胎盤(pán)生長(zhǎng)發(fā)育主要的影響因子，在胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖分化過(guò)程中起著重要作用，并對(duì)細(xì)胞生理功能具有顯著影響。圖3結(jié)果顯示，常氧條件與低氧條件下PLGFmRNA的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明PLGFmRNA的表達(dá)不受氧分壓變化的影響。

圖3 常氧與低氧條件下 hTERT-BTC中PLGF mRNA的表達(dá)情況Fig.3 Expression of PLGF mRNA in hTERT-BTC under normoxia and hypoxia conditions

2.4 低氧條件下E-Cadherin表達(dá)

圖4顯示，E-Cadherin的表達(dá)量在低氧環(huán)境下表現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)，說(shuō)明低氧環(huán)境會(huì)使E-Cadherin表達(dá)量減少。

圖4 常氧與低氧條件下hTERT-BTC中E-Cadherin的表達(dá)情況Fig.4 Expression of E-Cadherin in hTERT-BTC under normoxia and hypoxia conditions

3 討 論

氧氣是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的必要條件之一，是細(xì)胞的必要營(yíng)養(yǎng)素。氧氣含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)引起機(jī)體的適應(yīng)性反應(yīng)，有研究表明子宮內(nèi)氧濃度能夠調(diào)節(jié)并影響胎盤(pán)的結(jié)構(gòu)和功能[13]。在人類(lèi)胎盤(pán)的研究過(guò)程中，人們對(duì)缺氧的作用有著不同的見(jiàn)解[14]。HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的低氧標(biāo)志物，本研究通過(guò)Western Blot檢測(cè)HIF-1α在胞內(nèi)的表達(dá)變化來(lái)篩選CoCl2濃度，并以此建立細(xì)胞體外低氧模型。有研究比較了兩種常用的低氧模型誘導(dǎo)劑CoCl2與DMOG，結(jié)果顯示，200 μM CoCl2可明顯引起HIF-1α的靶基因Glut1的表達(dá)增加，但對(duì)Vegfα無(wú)明顯影響；500 μM的DMOG則對(duì)Glut1和Vegfα均有明顯影響[15]。說(shuō)明CoCl2與DMOG均可用于建立體外低氧模型，但誘導(dǎo)低氧的作用機(jī)制或產(chǎn)生程度有所不同，從而使下游基因表達(dá)情況也出現(xiàn)不同趨勢(shì)。

有研究表明，低氧可以促進(jìn)人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移[16]。而對(duì)于反芻動(dòng)物，我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧環(huán)境下的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖緩慢，密度下降。這種結(jié)果的差異可能與試驗(yàn)對(duì)象的種族或發(fā)育狀態(tài)有關(guān)[17]。胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞由于其特殊性，本身具有遷移、侵襲功能，在胚胎著床后完成與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的接觸與融合，并進(jìn)一步遷移、浸潤(rùn)完成胎盤(pán)血管系統(tǒng)的建立[2]。本研究的結(jié)果顯示，在低氧環(huán)境中，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的遷移減緩、遷移率下降、浸潤(rùn)率降低等滋養(yǎng)層細(xì)胞功能衰退的現(xiàn)象。研究表明，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、分化的能力受損可能與不明原因的自然流產(chǎn)有關(guān)[18]。

胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)作為影響胎盤(pán)生長(zhǎng)發(fā)育的主要因子，對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，其通過(guò)自分泌或(和)旁分泌方式對(duì)自身及周?chē)?xì)胞均有不同程度的作用[19]。Fumihito Nishimoto等[20]通過(guò)CoCl2誘導(dǎo)獲得低氧環(huán)境，對(duì)來(lái)自于人胎盤(pán)分離出的原代滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增和ELISA試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境下PLGFmRNA的表達(dá)水平顯著降低，但是HIF-1α不改變PLGFmRNA的表達(dá)。對(duì)于以奶牛為代表的反芻動(dòng)物，試驗(yàn)結(jié)果顯示，PLGFmRNA的表達(dá)不受氧分壓變化的影響，推測(cè)低氧環(huán)境下，各因子對(duì)其的影響主要作用于蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，這為后續(xù)研究提供了新的方向。

E-Cadherin是上皮細(xì)胞表達(dá)的特殊表面黏附分子，可作為上皮細(xì)胞形態(tài)特征的重要參考因子，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞作為上皮樣細(xì)胞，E-Cadherin在其發(fā)育轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有重要意義，尤其表現(xiàn)在涉及胎盤(pán)血管生成的生理過(guò)程。有研究結(jié)果表明，低氧通過(guò)HIF-1α誘導(dǎo)Snail上調(diào)，從而導(dǎo)致E-Cadherin表達(dá)量下降[21]，本研究結(jié)果與此相吻合。低氧環(huán)境導(dǎo)致的E-Cadherin蛋白表達(dá)減少可能與細(xì)胞形態(tài)變化、偽足減少等有關(guān)。

總之，本研究利用CoCl2成功構(gòu)建了奶牛胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞低氧模型，利用該模型系統(tǒng)的研究了低氧狀態(tài)對(duì)于奶牛胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞造成的一系列影響，為探究奶牛胎盤(pán)早期發(fā)育奠定理論基礎(chǔ)。