沙繼斌+陳巖+萬(wàn)利+葛新發(fā)

山東體育學(xué)院學(xué)報(bào)第30卷第6期2014年12月 沙繼斌，等不同時(shí)程低氧暴露對(duì)大鼠髓源性細(xì)胞HIF-1α與hGlyrichin表達(dá)影響的研究No.6 2014已有研究證明低氧應(yīng)答的核心元件HIF-1α與機(jī)體固有免疫機(jī)能存在密切聯(lián)系，HIF-1α表達(dá)上調(diào)可激活血液中的髓源性細(xì)胞使固有免疫應(yīng)答增強(qiáng)[1]，并可上調(diào)抗菌肽的表達(dá)；HIF-1α的增效劑含羞草堿[2]及近期報(bào)道的HIF-1α穩(wěn)定劑AKB-4924[3]自身并無(wú)抗菌活性，但可以通過(guò)提高胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞的抗菌活性，有效抑殺具有甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌。hGlyrichin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的富含甘氨酸的新型抗菌肽家系的重要人源性成員，其結(jié)構(gòu)及抗菌活性已得到初步確證[4-5]。本研究嘗試同步觀察不同時(shí)程低氧暴露對(duì)HIF-1α表達(dá)及hGlyrichin表達(dá)的影響，為分析二者之間的可能聯(lián)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠60只，體重207±11.4 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（軍）2007-004），隨機(jī)分為對(duì)照組、低氧12、24、36、48、72小時(shí)組，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。采用hypoxico系統(tǒng)模擬海拔2500米常壓低氧環(huán)境以進(jìn)行間歇性低氧暴露，每日2小時(shí)。累計(jì)低氧暴露時(shí)間分別為12、24、36、48、72小時(shí)后，尾靜脈收集靜脈血，肝素抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液分離去除淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，然后用右旋糖酐（dextran） 沉降與低滲法去除紅細(xì)胞，從而得到純度較高的多形核白細(xì)胞，-80℃保存以備指標(biāo)測(cè)定。

1.2主要試劑淋巴細(xì)胞分離液（購(gòu)自Gibco），Trizol（購(gòu)自Invitrogen），RT-PCR試劑盒（購(gòu)自Promega），丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS（購(gòu)自Sigma），HIF-1α抗體（購(gòu)自Abcam），IPG膠條及buffer（購(gòu)自Bio-rad），常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純

1.3引物序列hGlyrichin上游引物： 5-CGCATGCCGGTGGCCGTGGGT-3， 下游引物：5-CCGTTAGCATCGGATGCCCAT-3；HIF-1α上游引物：5-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3，下游引物：5-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3；G3PDH上游引物：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3；均由英駿公司合成。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1RNA提取以1‰DEPC水處理所有提取RNA用品，用Trizol裂解液按照《分子克隆指南》RNA提取方法從多形核白細(xì)胞中提取RNA，所有離心操作均在4℃冷凍離心機(jī)中進(jìn)行，收集RNA沉淀后在無(wú)菌操作臺(tái)中風(fēng)干，而后將沉淀溶于20 μl 去離子水，瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取RNA。

1.4.2RT-PCR

1.4.2.1逆轉(zhuǎn)錄取所提取RNA10μg與Oligod（T）1 μl混勻后，65℃水浴10 min后迅速置于冰上冷卻5 min，按照如下反應(yīng)體系依次加入下列試劑：RNA酶抑制劑3 ul，AMV RT5×Reactiong Buffer1 ul，100mM DTT1ul，10mM dNTP 4ul，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1ul，1‰ DEPC 水加至總體積為20 ul，混勻后置于42℃恒溫箱中反應(yīng)1 h，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2 μl作為PCR模板，同時(shí)以G3PDH作為內(nèi)參。

1.4.2.2PCR逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA2ul，hGlyrichin/HIF-1α上游引物0.5 ul，hGlyrichin/HIF-1α下游引物0.5 ul，G3PDH上游引物0.5 ul，G3PDH下游引物0.5 ul，2.5 μM dNTP4 ul，10×PCR緩沖液2 ul，rTaq酶0.5 ul，ddH2O加至總體積為20 ul；95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR結(jié)果。

1.4.3Western BlotSDS-PAGE結(jié)束后取下凝膠，在電轉(zhuǎn)儀中與預(yù)處理過(guò)PVDF膜按次序疊放好，采用半干法轉(zhuǎn)膜，電壓12 V，轉(zhuǎn)膜30 min；將電轉(zhuǎn)后的膜在2.5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h；TBS沖洗3次，5 min/次；用TBS按1：3000稀釋兔源HIF-1α一抗，與PVDF膜作用2 h；TBST沖洗3遍，每次15 min；用TBS按1：5000稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，與PVDF膜作用2 h；TBST沖洗3遍，每次15 min；將A液、B液等體積混合，將混合物覆蓋在膜表面1～2 min，在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面放入暗盒中，曝光1 min后顯影、定影，定影后用去離子水沖洗，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，觀察結(jié)果。

1.4.4雙向電泳取對(duì)照組與低氧72小時(shí)組收集所得髓源性細(xì)胞制備蛋白樣品后參照Gorg教授實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行雙向電泳，膠條室溫下平衡10分鐘后，被動(dòng)式泡脹，而后進(jìn)行第一向等電聚焦（IEF）IEF結(jié)束后將膠條平衡兩次，采用12.5%的SDS膠進(jìn)行第二向，電泳結(jié)束后取下凝膠用雙蒸水漂洗三次，參照EMBL的考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行染色加以優(yōu)化，染色中止后用ImageScanner II 掃描儀掃描，然后用Image Master 2D Planium進(jìn)行分析。將其中差異較大的四個(gè)樣品送質(zhì)譜檢測(cè)，常規(guī)檢索條件設(shè)置：其中Mass values選擇 Monoisotopic ，Peptide Mass Tolerance設(shè)定為 ± 0.3 Da，Peptide Charge State設(shè)定為 1+ ，Max Missed Cleavages設(shè)定為1 ，Number of queries值設(shè)定為25。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1不同時(shí)程間歇性低氧暴露后多形核白細(xì)胞HIF-1α及hGlyrichin RT-PCR結(jié)果

2.1.1間歇性低氧后多形核白細(xì)胞RNA提取

如圖1所示，從大鼠多形核白細(xì)胞中所提取到的RNA 18s與28s兩條帶清晰、完整，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/ OD280比值在1.8-2.0之間，表明所提取的RNA質(zhì)量較好，適合用于下一步的RT-PCR。

圖1間歇性低氧暴露后多形核白細(xì)胞RNA電泳結(jié)果

1、2、3、4、5：間歇性低氧暴露12 h、24 h、36 h、48 h、72 h組多形核白細(xì)胞RNA；M：DL20002.1.2不同時(shí)程間歇性低氧暴露后多形核白細(xì)胞HIF-1α及hGlyrichin的mRNA表達(dá)變化

如圖2所示，間歇性低氧暴露12 h后未見(jiàn)有HIF-1α條帶，在間歇性低氧暴露24 h后其表達(dá)量依然很低，未見(jiàn)明顯條帶，間歇性低氧暴露36 h后開(kāi)始出現(xiàn)較明顯條帶，繼而在間歇性低氧暴露48 h組、間歇性低氧暴露72 h組中HIF-1α表達(dá)量持續(xù)顯著增加；與之相比，在不同時(shí)程間歇性低氧暴露后，hGlyrichin表達(dá)量未見(jiàn)有顯著改變。以上結(jié)果提示HIF-1α作為機(jī)體低氧應(yīng)答的核心元件，對(duì)低氧刺激較為敏感，但較短時(shí)間低氧暴露并未使HIF-1α表達(dá)顯著上升，在低氧處理36 h后其表達(dá)量明顯升高且隨時(shí)程延長(zhǎng)而持續(xù)增加。hGlyrichin作為一種在不同組織中廣泛分布的抗菌肽，可能由于本地表達(dá)水平較高，間歇性低氧暴露后其表達(dá)量并未受到低氧刺激的顯著影響。

圖2對(duì)照組與不同時(shí)程間歇性低氧暴露組

RT-PCR電泳結(jié)果

1.對(duì)照組； 2. 間歇性低氧暴露12 h組； 3. 間歇性低氧暴露24 h組；4. 間歇性低氧暴露36 h組；5. 間歇性低氧暴露48 h組；6. 間歇性低氧暴露72 h組，下同。2.2不同時(shí)程間歇性低氧暴露后多形核白細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)變化

如圖3所示，與內(nèi)參β-actin相比，HIF-1α蛋白表達(dá)量隨間歇性低氧暴露時(shí)程的而持續(xù)增加，其變化趨勢(shì)與RT-PCR結(jié)果基本一致。稍有不同的是，與RT-PCR結(jié)果相比，在間歇性低氧暴露24 h后蛋白印漬檢測(cè)已可見(jiàn)到較為顯著條帶。由于內(nèi)參β-actin條帶灰度差異較大，故未進(jìn)行定量分析比較。

圖3對(duì)照組與不同時(shí)程間歇性低氧暴露組

Western Blot結(jié)果2.3不同時(shí)程間歇性低氧暴露后多形核白細(xì)胞蛋白質(zhì)差異表達(dá)結(jié)果

蛋白樣品定量：以1 mg/ml的BSA溶液作為標(biāo)準(zhǔn)。分別取0、2.5、5、7.5、10、15、20、25 μl標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液于1.5 ml離心管中，加雙蒸水稀釋至100 μl，再加入1 ml工作液，混合均勻，60 min之內(nèi)測(cè)出每管混合液在595 nm處的吸光度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，A595nm為縱坐標(biāo)做工作曲線，如圖2～圖4。樣品的測(cè)定方法同上。分別取1、2、3、5、7.5、10 μl待測(cè)蛋白于1.5 ml離心管中，加入雙蒸水稀釋至100 μl，將蛋白樣品稀釋至合適濃度，按上述操作程序測(cè)定595 nm處的吸光度，按工作曲線測(cè)定樣品濃度，而后上樣。

雙向電泳膠圖顯示與對(duì)照組相比， 間歇性低氧暴露72 h后蛋白表達(dá)總體似呈下降趨勢(shì)（圖4a），經(jīng)軟件比對(duì)后選取其中四個(gè)表達(dá)量差異較為顯著的點(diǎn)（圖4b）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中A、B、C三點(diǎn)表達(dá)量顯著增加，D點(diǎn)表達(dá)量顯著下降，質(zhì)譜鑒定結(jié)果B點(diǎn)蛋白質(zhì)為tropomyosin 4 ，低氧后其表達(dá)量顯著增高，其余未檢索出結(jié)果。

圖4對(duì)照組與間歇性低氧暴露

72 h組蛋白質(zhì)差異表達(dá)結(jié)果

a .雙向電泳結(jié)果比較；b.有顯著表達(dá)差異蛋白點(diǎn)比較

3分析討論

對(duì)低氧生理應(yīng)答的認(rèn)識(shí)相繼經(jīng)歷了由經(jīng)典低氧效應(yīng)到促紅細(xì)胞生成素（EPO），由EPO 到低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1），由HIF-1到氧感受器如脯氨酰羥化酶、天冬酰胺酰羥化酶的過(guò)程[1，6]，其中HIF-1在細(xì)胞低氧應(yīng)答反應(yīng)體系中居于核心地位。一般認(rèn)為，低氧條件下，機(jī)體氧感受器感受到低氧信號(hào)刺激后，通過(guò)低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起一系列應(yīng)激性變化從而產(chǎn)生低氧適應(yīng)，HIF-1在介導(dǎo)低氧應(yīng)答過(guò)程中起著重要作用。

3.1不同時(shí)程間歇性低氧暴露后多形核白細(xì)胞HIF-1α表達(dá)變化

HIF-1是由α和β兩個(gè)亞基組成異二聚體蛋白，HIF-1β為HIF-1的組成性表達(dá)亞基，而HIF-1α則為HIF-l的氧調(diào)節(jié)亞基。HIF-1α通常在穩(wěn)定后移位入核，與配體芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子結(jié)合，而后通過(guò)與低氧應(yīng)答元件的5端增強(qiáng)子序列結(jié)合而后激活其它特定的基因，可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官不同水平的缺氧應(yīng)答反應(yīng)以維持氧穩(wěn)態(tài)。[1]

已有研究證實(shí)HIF-1α在大鼠的一些器官中（腦、心、腎、肝、肺、骨骼?。┢毡楸磉_(dá)，且在腦、肺、骨骼肌、腎可被低氧顯著誘導(dǎo)。低氧習(xí)服是機(jī)體在外界脅迫條件下，為了維持自身的穩(wěn)定，減輕低氧對(duì)機(jī)體的損傷而采取的自身防御措施。低氧訓(xùn)練應(yīng)激對(duì)機(jī)體的刺激受不同氧濃度（模擬海拔高度）、低氧刺激時(shí)間、刺激方式條件影響，結(jié)果可能存在差異，但大多數(shù)研究結(jié)果支持在低氧應(yīng)激后HIF-1α表達(dá)上調(diào)。[6]

王雪冰等研究發(fā)現(xiàn)[7]，相當(dāng)于海拔3 500 m低氧訓(xùn)練4周后大鼠腎皮質(zhì)HIF-1α、VEGF mRNA水平均呈顯著上調(diào)，且HIF-1α與VEGF表達(dá)呈高度正相關(guān)。趙鵬等的研究結(jié)果也證實(shí)低氧和訓(xùn)練能增加人體和動(dòng)物骨骼肌 VEGF mRNA 水平[8]。汪曉筠等的研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，高原組大鼠血清中HIF-1α含量明顯增高，血漿中ROS含量明顯降低[9]。以上研究結(jié)果與我們的結(jié)果很相近，我們發(fā)現(xiàn)在間歇性低氧暴露時(shí)程累加到36小時(shí)后，HIF-1α mRNA水平開(kāi)始出現(xiàn)顯著升高，之后隨時(shí)程延長(zhǎng)其水平依然升高且具有顯著性。HIF-1α表達(dá)上調(diào)除可影響VEGF外，對(duì)其他下游因子同樣有較強(qiáng)調(diào)節(jié)效應(yīng)，如黃麗英等的研究結(jié)果表明低氧運(yùn)動(dòng)后血清EPO水平顯著上升，腎臟EPO mRNA水平顯著升高[10]，低氧后HIF-1α表達(dá)增加是促進(jìn)EPO產(chǎn)生分泌的主要因子。

低氧應(yīng)激除可調(diào)節(jié)HIF-1α轉(zhuǎn)錄之外，還可以有效調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白表達(dá)。瞿樹(shù)林課題組利用免疫組織化學(xué)染色觀察到模擬高海拔低氧環(huán)境及力竭性運(yùn)動(dòng)均可促進(jìn)心、肝、腎HIF-1a 蛋白表達(dá)[11]，在低氧應(yīng)激后心、肝、腎均可見(jiàn)到多量HIF-1α免疫陽(yáng)性物質(zhì)，主要集中于胞漿中，少量可見(jiàn)在胞核中表達(dá)。劉銘等將大鼠置于模擬海拔4000m高度的低氧倉(cāng)中，持續(xù)低氧刺激4周后用免疫組化法檢測(cè)大鼠骨骼肌組織HIF-1α蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α在低氧應(yīng)激后表達(dá)上調(diào)[12]，其表達(dá)水平隨著低氧刺激的時(shí)間延長(zhǎng)而增高。我們采用蛋白印漬檢測(cè)了不同時(shí)程間歇性低氧暴露后HIF-1α的蛋白表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在間歇性低氧暴露時(shí)間累加至24小時(shí)后有較明顯表達(dá)增加，之后表達(dá)水平隨間歇性低氧暴露時(shí)程延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，由于對(duì)照β-actin檢測(cè)表達(dá)水平不夠穩(wěn)定，未進(jìn)行定量分析。該結(jié)果與上述研究者結(jié)果相類似，但與所檢測(cè)到的HIF-1α mRNA水平在間歇性低氧暴露累計(jì)到36小時(shí)后才開(kāi)始有顯著升高的變化趨勢(shì)并不一致。用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)差異表達(dá)時(shí)只鑒定出tropomyosin 4一種蛋白質(zhì)，作為原肌球蛋白家族的一員，目前尚未有其與低氧密切相關(guān)的研究報(bào)道。

3.2不同時(shí)程間歇性低氧暴露后多形核白細(xì)胞抗菌肽hGlyrichin表達(dá)變化

固有免疫是機(jī)體抵御外來(lái)的細(xì)菌、病毒及其他有害病原體的古老應(yīng)激反應(yīng)，是維系組織穩(wěn)態(tài)及正常生命的必備先決條件，已有研究證實(shí)低氧與機(jī)體免疫力密切相關(guān)。人體中不同部位與區(qū)域氧分壓差別極大，肺泡毛細(xì)血管氧分壓約為100 mmHg，而淋巴器官氧分壓則可能降至約4 mmHg，上述不同部位及區(qū)域微環(huán)境的巨大差異使得固有免疫相關(guān)髓源性細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的代謝性適應(yīng)，氧分壓改變成為調(diào)節(jié)髓源性細(xì)胞機(jī)能的重要信號(hào)。

固有免疫系統(tǒng)的髓源性細(xì)胞在正常情況下都處于靜息狀態(tài)，而活性氧誘發(fā)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性損傷可導(dǎo)致髓源性細(xì)胞的激活，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)可能是低氧與固有免疫的交叉點(diǎn)之一。固有免疫系統(tǒng)中的多型核白細(xì)胞可通過(guò)氧依賴性以及非氧依賴性的兩方面抗菌系統(tǒng)來(lái)發(fā)現(xiàn)、識(shí)別、吞噬、最終消滅入侵的病原微生物， PMN細(xì)胞數(shù)目的減少意味著機(jī)體免疫機(jī)能抑制或者說(shuō)被感染的危險(xiǎn)性增加。

HIF-1α在與病原微生物接觸后隨即被激活而后調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞的固有免疫機(jī)能[13-14]，抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）是固有免疫系統(tǒng)的重要成分之一，具有直接抑殺病原微生物與針對(duì)宿主進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的雙重作用。在HIF-1被選擇性敲除的角質(zhì)細(xì)胞當(dāng)中，cathelicidin的分泌顯著減少，而壞死區(qū)域皮膚金黃色葡萄球菌的數(shù)量增加，反之，如果與HIF-1結(jié)合的腫瘤抑制蛋白VHL缺失的話，cathelicidin的分泌增加，金黃色葡萄球菌的感染率下降[15]，以上結(jié)果提示HIF-1對(duì)于抗菌肽的產(chǎn)生有直接調(diào)節(jié)作用[13-15]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在間歇性低氧暴露后隨時(shí)程延長(zhǎng)hGlyrichin表達(dá)水平有上升趨勢(shì)，但在不同時(shí)程時(shí)間點(diǎn)之間未觀察到顯著性差異。這可能與hGlyrichin本身是一種廣布于機(jī)體各組織的富含甘氨酸的天然抗菌肽，其在血液中本底表達(dá)水平較高有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果未能驗(yàn)證不同時(shí)程間歇性低氧暴露后機(jī)體HIF-1α表達(dá)水平上調(diào)可促進(jìn)hGlyrichin的表達(dá)的假設(shè)。

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振動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠跟腱生物力學(xué)性能影響的實(shí)驗(yàn)研究

The Experimental Research of Vibration Training on Biomechanical Properties of Rat Achilles Tendon