李霓，韓江雪，姜新海，許艷妮，司書(shū)毅

低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）是細(xì)胞表面型受體，在肝臟細(xì)胞中呈高表達(dá)，它通過(guò)胞吞作用將血漿中的 LDL-C轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟中進(jìn)行代謝，從而降低血漿中 LDL-C水平，是治療動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）疾病的重要靶點(diǎn)[1-2]。LDLR 的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄水平主要受固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-2（sterol regulatory element binding protein-2，SREBP-2）的調(diào)控[3]；除此之外，LDLR的誘導(dǎo)型降解因子（inducible degrader of the LDL receptor，IDOL）和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平對(duì) LDLR 的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[4-5]。

IDOL 是一個(gè)依賴(lài)于固醇調(diào)節(jié)的 E3 泛素連接酶，能夠介導(dǎo) LDLR 泛素化進(jìn)而經(jīng)溶酶體途徑降解，主要受到肝 X 受體（liver X receptor，LXR）的調(diào)控，這與 PCSK9 對(duì) LDLR 的降解機(jī)制有所不同[4,6]。IDOL 包含兩個(gè)主要功能結(jié)構(gòu)域，即 N端的 FERM 區(qū)和 C 端的 RING 區(qū)[7]。FERM 區(qū)負(fù)責(zé)與 LDLR 胞內(nèi)部分相結(jié)合，RING 區(qū)與泛素結(jié)合酶 E2D（ubiquitin conjugating enzyme E2D，UBE2D）結(jié)合，隨后 LDLR 被 UBE2D 泛素化修飾，最終導(dǎo)致 LDLR 在溶酶體降解[8]。研究表明，抑制 IDOL 對(duì) LDLR 的降解將有效提高肝臟LDLR 表達(dá)，有利于減少血漿中 LDL-C 水平[9]。因此，抑制 IDOL/LDLR 蛋白相互作用是抗 AS 藥物研發(fā)的新思路。有學(xué)者對(duì) IDOL 與 LDLR 的相互作用以及降解機(jī)制進(jìn)行了透徹的研究，并通過(guò)同源模建、染色質(zhì)免疫共沉淀等手段確證了兩個(gè)蛋白的結(jié)合界面[10]。熒光偏振（fluorescence polarization，F(xiàn)P）技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，是體外水平研究蛋白質(zhì)相互作用的重要方法[11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)并純化獲得人全長(zhǎng) IDOL重組蛋白，將能夠與 IDOL-FERM 區(qū)相結(jié)合的LDLR 多肽片段進(jìn)行異硫氰酸熒光素（fluorescence isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光標(biāo)記，利用熒光偏振方法，建立體外 IDOL/LDLR 的蛋白相互作用體系，確定 IDOL 與 LDLR 作用區(qū)域，探索最適條件，為基于 IDOL/LDLR 相互作用的抗 AS 小分子抑制劑的開(kāi)發(fā)和評(píng)價(jià)提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 pET-30a(+) 原核表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó) Novagen 公司；pCMV3-IDOL 商品化質(zhì)粒購(gòu)自義翹神州公司；大腸桿菌E. coliDH5α 克隆感受態(tài)細(xì)胞和E. coliTransetta(DE3) 表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司。

1.1.2 試劑 DNA marker、膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自北京全式金公司；DNA 連接酶購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自日本Takara 公司；DNA 聚合酶 2 × Es Taq MasterMix購(gòu)自康為世紀(jì)公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó) ThermoFisher 公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉均購(gòu)自英國(guó) Oxoid 公司；硫酸卡那霉素和異丙基 β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司；HisTrap 層析柱購(gòu)自美國(guó) GE 公司；384 孔不透明黑色檢測(cè)板購(gòu)自美國(guó) Corning 公司；其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 AKTA explorer 型蛋白層析系統(tǒng)為美國(guó) GE Health 公司產(chǎn)品；3-18K 型高速冷凍離心機(jī)為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；TS 型高壓細(xì)胞破碎儀為北京康坦科技有限公司產(chǎn)品；EnVision 2104型酶標(biāo)儀為美國(guó) PerkinElmer 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中查得IDOL（NM_013262.3）基因全長(zhǎng)為 1338 bp，共編碼 445 個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為 50 kD。根據(jù)其編碼序列設(shè)計(jì)引物，上游：5' CGGGATCCATGC TGTGTTATGTGACGA 3'（下劃線(xiàn)部分為BamH I酶切位點(diǎn)）；下游：5' CCGCTCGAGTTAGATTACA GTCAGATTGAGAA 3'（下劃線(xiàn)部分為XhoI 酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增全長(zhǎng)片段，引物由睿博興科有限公司合成。

1.2.2 pET-30a-IDOL 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 pCMV3-IDOL 質(zhì)粒含有 IDOL ORF，因此，以該質(zhì)粒為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增人全長(zhǎng) IDOL 基因。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

將 IDOL 的 PCR 產(chǎn)物及質(zhì)粒 pET-30a(+) 分別進(jìn)行BamH I 和XhoI 雙酶切反應(yīng)，經(jīng) T4 DNA連接酶 4 ℃ 連接 12 h，之后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落 PCR 及雙酶切鑒定后，送測(cè)序。經(jīng)鑒定序列正確，重組表達(dá)質(zhì)粒命名為 pET-30a-IDOL。

1.2.3 His-IDOL 蛋白的原核表達(dá)及純化 將pET-30a-IDOL 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTransetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，挑取單克隆于 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待OD600達(dá) 0.6 時(shí)，加入終濃度為 0.5 mmol/L 的 IPTG，分別于 15 ℃ 和37 ℃ 條件下，100 r/min 過(guò)夜誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。之后離心并收集菌體，超聲破碎后，利用SDS-PAGE 電泳分別檢測(cè)兩種誘導(dǎo)條件對(duì)重組蛋白全菌以及上清表達(dá)水平的影響。

將 600 ml 過(guò)夜誘導(dǎo)的菌體離心，用上樣緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.4）重懸菌體，采用高壓細(xì)胞破碎儀裂解菌體，4 ℃ 高速離心后將上清液用 0.45 mm 濾膜過(guò)濾。由于表達(dá)的重組 IDOL 蛋白帶有 His 標(biāo)簽，因此采用Ni2+螯合的 HisTrap HP 親和層析柱進(jìn)行層析，用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）進(jìn)行梯度洗脫，收集對(duì)應(yīng)洗脫峰蛋白并利用 BCA 試劑盒定量以及 SDS-PAGE 電泳鑒定。

1.2.4 多肽的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，LDLR 的 811 ～ 833 位氨基酸可與 IDOL 蛋白相互作用，因此，我們以 FITC 標(biāo)記該氨基酸片段，便于后續(xù)熒光偏振測(cè)定。FITC 標(biāo)記的 LDLR 多肽熒光探針（FITC-LDLR：FITC-CKNWRLKNINSINF DNPVYQKTTE）由上海強(qiáng)耀生物公司合成，并用DMSO 溶解為 2 mmol/L 溶液，于 -20 ℃ 保存。

1.2.5 FITC-LDLR 多肽最佳反應(yīng)濃度的確定 將2 mmol/L FITC-LDLR 以 FP 反應(yīng)緩沖液（PBS，0.01% Triton X-100，0.1 mg/ml BSA，pH 7.4）進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)两K濃度分別為 1000、500、250、125、62.5、31.25、15、7.5、3.75、1.875 nmol/L，依次加入到 384 孔板中，每孔 20 μl，設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)孔，于 25 ℃ 避光 100 r/min 振蕩孵育 30 min，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè) ΔmP 值，摸索最適多肽濃度。

1.2.6 His-IDOL 與 FITC-LDLR 結(jié)合實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性測(cè)定 將純化后的 His-IDOL（30 μmol/L）蛋白以 FP 反應(yīng)緩沖液進(jìn)行 2 倍稀釋?zhuān)来渭尤胫?84 孔板中，每孔 10 μl，使得蛋白終濃度分別為15 000、7500、3750、1875、960、480、240、120、60、30、15 nmol/L，之后加入 2 μl FITC-LDLR（終濃度 500 nmol/L），8 μl FP 反應(yīng)緩沖液，總反應(yīng)體系為 20 μl。設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)孔，于 25 ℃ 避光100 r/min 振蕩孵育 30 min，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)ΔmP 值。將上述反應(yīng)分別于 30 min、1 h、2 h 反應(yīng)，摸索最佳反應(yīng)時(shí)間。以 GraphPad Prism5.0 軟件擬合結(jié)合曲線(xiàn)，計(jì)算 His-IDOL 與 FITC-LDLR結(jié)合反應(yīng)的解離平衡常數(shù)（Kd）以及蛋白的半數(shù)有效濃度（EC50）。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-30a-IDOL 的構(gòu)建

以 pCMV3-IDOL 質(zhì)粒為模板，對(duì)人 IDOL 全長(zhǎng)基因片段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，800 ～1500 bp 之間有一條特異性明亮條帶，目的基因大小相符（圖1A）。將經(jīng)過(guò)BamH I 和XhoI 雙酶切的 IDOL PCR 產(chǎn)物與 pET-30a(+) 空載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。結(jié)果顯示，菌株 1 ～ 4 號(hào)均擴(kuò)增出與目的基因大小相符的條帶（圖1B）。之后從中挑取菌株 1 保菌并提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和XhoI 雙酶切后，顯示約 1344 bp 大小的條帶，與目的基因大小一致（圖1C）。同時(shí)，將該陽(yáng)性克隆測(cè)序，結(jié)果與目標(biāo)基因序列完全一致。上述結(jié)果表明，我們成功構(gòu)建了 pET-30a-IDOL 原核表達(dá)質(zhì)粒。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-30a-IDOL 的構(gòu)建[A：IDOL 基因的 PCR 擴(kuò)增（M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 ～ 3：IDOL 基因的 PCR產(chǎn)物）；B：菌落 PCR 鑒定（M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 ～ 4：pET-30a-IDOL 菌落 PCR 產(chǎn)物）；C：重組質(zhì)粒 pET-30a-IDOL的雙酶切鑒定（M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒 pET-30a-IDOL；2：未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒 pET-30a-IDOL）]Figure 1 The construction of pET-30a-IDOL recombinant plasmid [A: PCR amplification of IDOL gene (M: DNA marker;1 - 3: PCR product of IDOL); B: PCR of IDOL in E.coli DH5α (M: DNA marker; 1 - 4: PCR product of pET-30a-IDOL in E.coli DH5α); C: Digestion identification of pET-30a-IDOL recombinant plasmid (M: DNA marker; 1: Digestion product of pET-30a-IDOL;2: pET-30a-IDOL recombinant plasmid)]

2.2 His-IDOL 重組蛋白的表達(dá)與純化

將 pET-30a-IDOL 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTransetta(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)化有空載體 pET-30a(+) 的菌株相比，15 ℃ 和 37 ℃ 條件下均表達(dá)出與目的蛋白大小一致的蛋白（約 55 kD）（圖2），說(shuō)明蛋白表達(dá)成功。由于低溫條件蛋白更易可溶性表達(dá)，因此，后續(xù)我們采用 0.5 mmol/L 的 IPTG、15 ℃、100 r/min 過(guò)夜條件，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。經(jīng)HisTrap 層析柱分離純化后，收集不同咪唑濃度下洗脫的蛋白，并進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析。結(jié)果表明，200 mmol/L 及 300 mmol/L 咪唑濃度洗脫均能夠獲得較高純度的 His-IDOL 重組蛋白（圖3）。將 300 mmol/L 咪唑濃度洗脫蛋白（＞ 90% 純度）富集，進(jìn)行超濾濃縮，用于后續(xù)熒光偏振實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

圖2 His-IDOL 的原核表達(dá)Figure 2 The expression of His-IDOL

圖3 His-IDOL 的蛋白純化原核表達(dá)Figure 3 The purification of His-IDOL

2.3 FITC-LDLR 最佳反應(yīng)濃度確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從 1000 nmol/L 開(kāi)始，隨著多肽濃度的降低，F(xiàn)ITC-LDLR在實(shí)驗(yàn)體系中的 ΔmP值表現(xiàn)出顯著升高的趨勢(shì)（圖4）。在熒光偏振體系中，僅有多肽存在時(shí)，ΔmP 值處于 25 ～ 50 之間為最佳，這與待測(cè)熒光標(biāo)記分子的分子量大小及構(gòu)象有直接關(guān)系。為了保持本實(shí)驗(yàn)體系具有較好的靈敏度及較低的本底值，選用 500 nmol/L FITC-LDLR 用于后續(xù)結(jié)合反應(yīng)。

圖4 最佳多肽濃度的確定Figure 4 Determination of the optimal concentration of peptides in FP assay

2.4 熒光反應(yīng)體系的確定

采用飽和曲線(xiàn)法，首先測(cè)定 His-IDOL 與FITC-LDLR 結(jié)合能力。熒光偏振實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，His-IDOL 與 FITC-LDLR 能夠很好地結(jié)合，并且在 10 μmol/L 濃度下達(dá)到飽和，最大 ΔmP 值為183，該反應(yīng)Kd值為 1.64 μmol/L（圖5A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著 His-IDOL 蛋白濃度的增加，蛋白的 EC50值逐漸升高，當(dāng) His-IDOL 約為 2 μmol/L時(shí)，ΔmP 值穩(wěn)定在 140 左右，此時(shí)具有較高靈敏度和較大信號(hào)窗（圖5B）。隨后，確定不同孵育時(shí)間對(duì)該反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，分別孵育 30 min、1 h 和 2 h 后，結(jié)合反應(yīng)的Kd值和ΔmP 值保持穩(wěn)定，對(duì)應(yīng)Kd值分別為 1.59、1.54和 1.63 μmol/L（圖5C）。本實(shí)驗(yàn)選擇 500 nmol/L FITC-LDLR 和 2 μmol/L His-IDOL 于 25 ℃、100 r/min 振蕩避光孵育 1 h 作為最優(yōu)反應(yīng)體系。該體系的成功構(gòu)建為研究 IDOL/LDLR 蛋白相互作用提供了新的方法。

圖5 IDOL/LDLR 相互作用的熒光偏振測(cè)定及優(yōu)化最佳多肽濃度的確定（A：飽和曲線(xiàn)測(cè)定；B：量效曲線(xiàn)測(cè)定；C：作用時(shí)間優(yōu)化）Figure 5 FP assay of IDOL/LDLR interaction and optimization (A: Saturation binding curves; B: Concentration-response curve;C: Optimization of reaction time)

3 討論

提升肝臟中 LDLR 表達(dá)水平對(duì)于預(yù)防高脂血癥具有重要意義，也是治療 AS 疾病的核心藥物靶點(diǎn)。目前臨床廣泛應(yīng)用的他汀類(lèi)藥物就是通過(guò)SREBP2 轉(zhuǎn)錄因子增加 LDLR 表達(dá)水平從而降低血漿 LDL-C 水平的。但他汀類(lèi)藥物副作用及局限性不容忽視[12-13]。除了受到轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控之外，LDLR 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控對(duì)于其蛋白水平同樣重要。IDOL（也稱(chēng)為 MYLIP），是能夠與 LDLR 結(jié)合的 E3 泛素連接酶，通過(guò)泛素化降解來(lái)調(diào)節(jié)LDLR 的表達(dá)水平。Zelcer 等[4]發(fā)現(xiàn)，IDOL 是LXR 的重要靶基因，不同細(xì)胞和組織中，LXR 的激動(dòng)劑，如 GW3965 和 T0901317 能夠上調(diào)IDOL 表達(dá)水平，從而抑制 LDLR 的表達(dá)。SREBP以及 LXR 是兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，共同維持著機(jī)體膽固醇水平的平衡，包括內(nèi)源性膽固醇的合成、多余膽固醇的外流和轉(zhuǎn)化等途徑[14-15]。LXR-IDOL-LDLR 軸平衡對(duì)于機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)十分重要，并且其對(duì) LDLR 的內(nèi)化和途徑溶酶體的降解過(guò)程不依賴(lài)于網(wǎng)格蛋白和小泡，這與 PCSK9對(duì) LDLR 的調(diào)控機(jī)制截然不同[16-17]。

抑制 IDOL 對(duì) LDLR 的降解，有利于提升肝臟 LDLR 表達(dá)水平，有望成為抗 AS 藥物開(kāi)發(fā)的新思路。2015年，Zhou 等[18]發(fā)現(xiàn) DHA 通過(guò)多重機(jī)制增加肝臟中 LDLR 的表達(dá)水平，其中包括通過(guò) LXR-IDOL 軸調(diào)控。另外，Nelson 等[19]利用抑制 IDOL 活性的手段，提高了 LDLR 肝臟中表達(dá)水平。由此可見(jiàn)，無(wú)論是下調(diào) IDOL 表達(dá)或者抑制其泛素連接酶活性，均能夠有效增加 LDLR 表達(dá)。以蛋白-蛋白相互作用為靶點(diǎn)的研究從功能角度更加接近細(xì)胞生理狀態(tài)，相對(duì)于以單個(gè)蛋白為靶點(diǎn)的體外篩選模型具有更好的選擇性和特異性，不易造成“脫靶”現(xiàn)象。熒光偏振是研究蛋白質(zhì)與小分子、多肽相互作用的重要方法，目前基于此方法建立的小分子抑制劑篩選模型以及評(píng)價(jià)體系在藥物研發(fā)領(lǐng)域得到了廣泛的使用[20]。因此，本研究基于熒光偏振方法建立體外 IDOL/LDLR 蛋白相互作用體系，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、重復(fù)度高等優(yōu)勢(shì)。

在不同國(guó)家和地區(qū)的 GWAS 調(diào)查中顯示，IDOL 蛋白表達(dá)水平與人類(lèi)血脂譜以及單核苷酸多態(tài)性具有密切相關(guān)性[21]。比如，2019年調(diào)查顯示，IDOL 蛋白的 G51S 突變體對(duì)于 LDLR 有更強(qiáng)的親和力以及降解活性，因此 G51S 突變體人群中LDL-C 明顯高于普通樣本值[22]；2020年在新疆維吾爾自治區(qū)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，漢族人群中 IDOL基因 rs9370867 與高血脂癥相關(guān)[23]。這些都說(shuō)明IDOL 蛋白對(duì)于高膽固醇血癥的調(diào)控具有重要的生理意義。隨著對(duì) IDOL 蛋白研究的逐步深入，IDOL的相關(guān)動(dòng)物模型以及與之有相互作用網(wǎng)絡(luò)的蛋白相繼出現(xiàn)。2016年，Ibrahim 等[24]利用腺病毒載體構(gòu)建了肝臟組織中特異表達(dá) IDOL 蛋白的人源化小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)該模型小鼠的血漿膽固醇水平顯著升高，由此，從整體動(dòng)物水平對(duì) IDOL 生理功能的研究也得到不斷豐富。因此，進(jìn)一步探索 IDOL蛋白的作用機(jī)制，圍繞 IDOL 蛋白開(kāi)展多元化靶點(diǎn)的研究，構(gòu)建合理有效的藥物篩選模型，對(duì)抗 AS藥物研發(fā)具有深遠(yuǎn)的意義。

綜上所述，本研究通過(guò)原核表達(dá)并純化獲得人全長(zhǎng) IDOL 蛋白，利用熒光偏振方法，建立體外IDOL/LDLR 的蛋白相互作用體系，確定 IDOL 與LDLR 作用方式以及最適反應(yīng)條件，為今后基于IDOL/LDLR 相互作用的小分子抑制劑的開(kāi)發(fā)和AS 疾病的治療提供了新的策略。