王虓宇，朱云，沈武玲，張名，蔡瑋，趙云蓉，劉暢，盧振攀，張明珠，平玲

近年來，隨著醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的快速發(fā)展，人們對醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來越高，對藥用包裝材料的質(zhì)量也提出更高要求[1]。生物制藥工藝從上游的培養(yǎng)基制備、細胞培養(yǎng)到下游純化、灌裝等一系列工藝來看，目前市場上有很多涉及生物制藥行業(yè)的廠商都可以提供全線的一次性使用系統(tǒng)。

我所自 2015年 Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（sIPV）上市以來，在該制品的生產(chǎn)過程中使用高硼硅玻璃瓶對單價原液進行長期儲存，用不銹鋼儲運罐進行三價半成品配制和暫存。而玻璃瓶和儲運罐的清洗、高壓滅菌、取樣、溶液混勻和清潔驗證等工序較繁瑣，準(zhǔn)備的周期較長，消耗人力物力。一次性生物工藝袋（或混合袋）因其廣泛的化學(xué)兼容性[2]，主要用于疫苗、生物制劑等藥品的混合、長期保存、生物反應(yīng)器的補液和收獲等，操作簡單。與傳統(tǒng)玻璃瓶和不銹鋼器材相比，它具有成本效益高、靈活、安全、對環(huán)境影響小、供應(yīng)鏈多樣性的優(yōu)勢。當(dāng)前市場上一次性生物工藝袋由多層高分子材料組成，廠家可提供產(chǎn)品提取實驗、遷移性及吸附性實驗結(jié)果[3-5]。但是，由于可提供一次性生物工藝袋的廠家較多，生物工藝袋的材料不盡相同，不同結(jié)構(gòu)材料制成的生物工藝袋的外觀、色澤、澄明度與機械強度亦存在不同。本實驗通過在不同儲存條件和不同儲存時間下使用三種品牌的一次性生物工藝袋對 sIPV 原液、三價半成品進行存儲，探討其對制品穩(wěn)定性的影響，為生物工藝袋是否適用于 sIPV 工藝提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 生物工藝袋 生物工藝袋由 PALL、Sartorius、Saint-Gobain 三個生產(chǎn)廠家提供，均為250 ml 容量規(guī)格。其中 PALL 生產(chǎn)的生物工藝袋產(chǎn)品接觸層至空氣阻隔層材料依次為超低密度聚乙烯（ULDPE）層、乙烯-乙烯醇共聚物（EVOH）層、ULDPE 層和聚酰胺（PA）層；Sartorius 生產(chǎn)的生物工藝袋依次為聚乙烯（PE）層、EVOH 層；Saint-Gobain 生產(chǎn)的生物工藝袋依次為低密度聚乙烯（LDPE）層、EVOH 層和 PA 層。

1.1.2 原液 I 型、II 型、III 型 sIPV 單價原液由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品四室提供，均由病毒純化液滅活后獲得。

1.1.3 三價半成品 sIPV 三價半成品由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品四室提供。三個型別 sIPV 單價原液與 M199 溶液按一定比例混合，加入 2-苯氧乙醇溶液至終濃度 5 mg/ml，混合均勻后配制完成。

1.1.4 主要試劑及儀器 Lowry 法蛋白含量測定試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Vero 細胞蛋白殘留量檢測試劑盒購自北京天壇生物制品股份有限公司；牛血清白蛋白殘留量測定試劑盒購自江蘇無錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開發(fā)有限公司；硫酸卡那霉素殘留檢測試劑盒購自北京勤邦生物技術(shù)有限公司；DNA 抽提試劑盒購自瑞士 Roche公司；Vero 細胞 DNA 殘留量測定標(biāo)準(zhǔn)品由中國食品藥品檢定研究院提供；酶標(biāo)儀購自美國 Biotek公司；96 孔酶標(biāo)板購自美國 Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 sIPV 原液分裝 sIPV I 型、II 型、III 型單價原液各一批（批號分別為 AIS20151001、AIS20152001、AIS20153001）分裝到三個品牌的生物工藝袋中（規(guī)格為 250 ml/袋，每袋原液裝量100 ml），每個品牌分裝 3 袋。

1.2.2 sIPV 三價半成品配制及分裝 取上述sIPV I 型、II 型、III 型單價原液，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制一批三價半成品（批號為 IS 半2015001）。將三價半成品分別分裝到三個品牌的生物工藝袋中，每個品牌分裝 9 袋（3 個溫度條件，每個條件各 3 袋）。

1.2.3 單價病毒原液穩(wěn)定性實驗 sIPV 原液的儲存條件及效期為 2 ～ 8 ℃ 下 1年。本研究中，將 I、II、III 型單價原液樣品放置于 2 ～ 8 ℃ 條件下 15 個月，分別在第 0 天、3、6、9、12 和15 個月檢測無菌實驗、D 抗原含量，以評價原液關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)是否符合要求。

1.2.4 三價半成品穩(wěn)定性實驗 sIPV 三價半成品配制完成后暫存于 2 ～ 8 ℃ 不超過 72 h 須進行灌裝。按照 2015 版《中華人民共和國藥典》第四部 9001《原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性實驗指導(dǎo)原則》和《藥品包裝材料與藥物相容性實驗指導(dǎo)原則》[6]的要求，對貯存袋中的樣品進行不同溫度、不同時間的穩(wěn)定性考察[7-8]。

1.2.4.1 三價半成品 2 ～ 8 ℃ 長期穩(wěn)定性實驗 將三價半成品樣品分裝于一次性生物工藝袋內(nèi)，放置于 2 ～ 8 ℃ 條件下 36 個月，第 0、24、36 個月檢查外觀，進行 2-苯氧乙醇、游離甲醛、Vero 細胞 DNA 殘留量、Vero 細胞宿主蛋白殘留量、牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量、大鼠效力實驗；在第 3 天和第 5 天進行無菌實驗和D 抗原含量檢測；在第 6、9、12、18、24、36 個月檢測 pH、蛋白含量、無菌實驗、細菌內(nèi)毒素、D 抗原含量、異常毒性實驗[9-10]。

1.2.4.2 三價半成品 25 ℃ 加速穩(wěn)定性實驗 在（25 ± 2）℃、相對濕度（60 ± 5）% 條件下，對三價半成品于第 1、2、3、6 個月檢查外觀、檢測 pH、無菌實驗、細菌內(nèi)毒素、D 抗原含量；第 6 個月增加異常毒性實驗和大鼠效力實驗。

1.2.4.3 三價半成品 37 ℃ 加速穩(wěn)定性實驗 在（37 ± 2）℃，相對濕度（75 ± 5）% 條件下，對三價半成品于第 7、14 天檢查外觀、檢測 pH、無菌實驗、細菌內(nèi)毒素、D 抗原含量；第 14 天增加異常毒性實驗和大鼠效力實驗。

1.2.5 D 抗原檢測 采用雙抗體夾心 ELISA法，以參考品 D 抗原含量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的A450值為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得曲線方程。再根據(jù)樣品A450值計算樣品的 D 抗原含量。每個品牌工藝袋各個溫度條件在每個時間點，自 3 個袋內(nèi)各取一份樣品進行獨立檢測，計算3 個檢測結(jié)果的均值即為相應(yīng)條件該時間點的 D抗原含量。

1.2.6 細菌內(nèi)毒素、Vero 細胞宿主蛋白殘留量、牛血清白蛋白殘留量及抗生素含量測定 參照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

1.2.7 無菌實驗、2-苯氧乙醇、游離甲醛、蛋白含量、Vero 細胞 DNA 殘留量、異常毒性實驗、大鼠效力實驗 參照《中國藥典》三部（2015 版）通則進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 Graphpad prism 軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪圖。以不同品牌作為不同處理組，在不同溫度下對穩(wěn)定性考察過程中樣品的 D 抗原回收率數(shù)據(jù)進行One-way ANOVA 分析，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。D 抗原回收率計算公式如下所示：回收率（%）= 待測樣品 D 抗原含量/分裝前初始樣品D 抗原含量 × 100%。

2 結(jié)果

2.1 單價病毒原液穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將三個品牌裝有 sIPV I、II、III 型單價原液的一次性生物工藝袋放置于 2 ～ 8 ℃ 冰箱內(nèi)，分別在規(guī)定的時間點取樣進行檢測。無菌檢查合格；I、II、III 型 D 抗原檢測結(jié)果在 15 個月時均在質(zhì)控范圍內(nèi)；對 D 抗原回收率（表1）進行統(tǒng)計學(xué)分析，在 15 個月內(nèi)各個時間點組間差異不顯著（P＞0.05），因此使用三種品牌中任意一種一次性生物工藝袋作為 sIPV 單價原液的存儲容器，對 D 抗原含量的影響無顯著性差異。

目前 sIPV 原液使用 10 L 或 20 L 高硼硅玻璃瓶儲存，根據(jù)前期生產(chǎn)驗證結(jié)果和工作成果[11]，將 2 ～ 8 ℃ 條件下貯存 15 個月高硼硅玻璃瓶儲存原液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)與三個品牌一次性生物工藝袋的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)共四組進行組間比較（表1），I 型、II 型、III 型 D 抗原回收率在 15 個月內(nèi)組間差異不顯著（P＞ 0.05）。

表1 一次性生物工藝袋和高硼硅玻璃瓶在 2 ～ 8 ℃ 下儲存 sIPV 單價原液 15 個月 D 抗原回收率Table 1 The results of recovery rate of D antigen of three brands single-use bags containing monovalent bulk of sIPV and in high borosilicate glass bottles stored at 2 - 8 ℃ for 15 months

2.2 三價半成品 2 ～ 8 ℃ 長期穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將三個品牌一次性生物工藝袋裝入配制好的sIPV 三價半成品放置于 2 ～ 8 ℃ 冰箱內(nèi)，分別在規(guī)定的不同時間點取樣進行檢測。肉眼觀察三個品牌一次性生物工藝袋包裝的樣品外觀都呈橘紅色，澄清透明，無異物；取樣檢測結(jié)果：pH 值在 6.5 ～7.5 內(nèi)，符合范圍；無菌檢查合格；細菌內(nèi)毒素＜ 20 EU/ml，2-苯氧乙醇在 4.0 ～ 6.0 mg/ml 范圍內(nèi)，游離甲醛 ＜ 50 μg/ml，蛋白含量 ＜ 20 μg/ml，Vero 細胞 DNA 殘留量 ＜ 100 pg/ml，牛血清白蛋白殘留量 ＜ 100 ng/ml，抗生素殘留量 ＜ 100 ng/ml，以上檢測結(jié)果均在合格范圍內(nèi)；異常毒性實驗結(jié)果合格，24 個月時大鼠效力實驗 3 個型別 ED50仍高于參考品 ED50。I 型、II 型、III 型 D 抗原檢測結(jié)果在 24 個月時均在質(zhì)控范圍內(nèi)，不同品牌工藝袋對 D 抗原含量的影響無顯著性差異。保存至36 個月，I 型和 II 型 D 抗原含量仍在質(zhì)控范圍內(nèi)，III 型 D 抗原含量已低于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)下限（圖1）。

圖1 sIPV 三價半成品儲存于 3 個品牌一次性生物工藝袋于 2 ～ 8 ℃ 保存 36 個月的 D 抗原穩(wěn)定性結(jié)果（兩條水平線分別表示 sIPV 三價半成品中 D 抗原標(biāo)準(zhǔn)的上下限）（A：I 型；B：II 型；C：III 型）Figure 1 The steability of D antigen content of final formulated bulk of sIPV stored in three brands of single-use bags at 2 - 8 ℃for 36 months (The two horizontal lines represent the upper and lower limits of D antigen content of final trivalent bulk of sIPV)(A: Type I; B: Type II; C: Type III)

2.3 三價半成品 25 ℃ 加速穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將三個品牌一次性生物工藝袋裝入配制好的sIPV 三價半成品放置于（25 ± 2）℃、相對濕度（60 ± 5）% 的恒溫箱內(nèi) 6 個月，分別在規(guī)定的不同時間點取樣進行檢測。肉眼觀察袋內(nèi)樣品，外觀均呈橘紅色，澄清透明無異物；取樣檢測結(jié)果：pH值在 6.5 ～ 7.5 內(nèi)，符合范圍；無菌檢查合格；細菌內(nèi)毒素 ＜ 20 EU/ml；檢測結(jié)果在合格范圍內(nèi)；異常毒性實驗結(jié)果合格；6 個月時大鼠效力實驗ED50高于參考品 ED50。I 型、II 型、III 型 D 抗原檢測結(jié)果在 6 個月時均在質(zhì)控范圍內(nèi)（圖2）。

圖2 sIPV 三價半成品儲存于 3 個品牌一次性生物工藝袋于（25 ± 2）℃ 保存 6 個月的 D 抗原穩(wěn)定性結(jié)果（兩條水平線分別表示 sIPV 三價半成品中 D 抗原標(biāo)準(zhǔn)的上下限）（A：I 型；B：II 型；C：III 型）Figure 2 The steability of D antigen content of final formulated bulk of sIPV stored in three brands of single-use bags at 25 ℃ for 6 months (The two horizontal lines represent the upper and lower limits of D antigen content of final trivalent bulk of sIPV) (A: Type I; B: Type II; C: Type III)

2.4 三價半成品 37 ℃ 加速穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將三個品牌一次性生物工藝袋裝入配制好的sIPV 三價半成品放置于（37 ± 2）℃、相對濕度（75 ± 5）% 的恒溫箱內(nèi) 14 d，分別在規(guī)定的不同時間點取樣進行檢測。肉眼觀察袋內(nèi)樣品，外觀均呈橘紅色，澄清透明無異物；pH 值在 6.5 ～ 7.5 內(nèi)，符合范圍；無菌檢查合格；細菌內(nèi)毒素 ＜ 20 EU/ml，檢測結(jié)果在合格范圍內(nèi)；異常毒性實驗結(jié)果合格；14 d 時大鼠效力實驗 ED50高于參考品 ED50。sIPV 半成品儲存于一次性生物工藝袋內(nèi)，在 37 ℃保存 14 d 后，I 型、II 型、III 型 D 抗原仍然均在質(zhì)控范圍內(nèi)（圖3）。

圖3 sIPV 三價半成品儲存于 3 個品牌一次性生物工藝袋于（37 ± 2）℃ 保存 14 d 的 D 抗原穩(wěn)定性結(jié)果（兩條水平線分別表示 sIPV 三價半成品中 D 抗原標(biāo)準(zhǔn)的上下限）（A：I 型；B：II 型；C：III 型）Figure 3 The steability of D antigen content of final formulated bulk of sIPV in three brands of single-use bags stored at 37 ℃ for 14 days (The two horizontal lines represent the upper and lower limits of D antigen content of final trivalent bulk of sIPV) (A: Type I;B: Type II; C: Type III)

2.5 在不同溫度穩(wěn)定性考察終點三價半成品的 D抗原回收率結(jié)果

以不同品牌一次性生物工藝袋作為分組，對不同溫度保存至穩(wěn)定性考察時間終點的樣品 D 抗原回收率（表2）進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，至長期穩(wěn)定性考察和加速穩(wěn)定性考察的終點，I、II 和III 型 D 抗原回收率在三個品牌一次性生物工藝袋組間差異不顯著（P＞ 0.05），因此，三種品牌一次性生物工藝袋作為 sIPV 三價半成品的存儲容器，對 D 抗原含量穩(wěn)定性的影響均無顯著性差異。

表2 裝有 sIPV 三價半成品的 3 種品牌一次性袋于（37 ± 2）℃ 儲存 14 d、（25 ± 2）℃ 儲存 6 個月和 2 ～ 8 ℃ 儲存 36 個月的 D 抗原回收率Table 2 Recovery rates of D antigen of final trivalent bulk of sIPV in three brands single-use bags stroed at 37/25/2 - 8 ℃ for 14 d/6 months/36 months

目前，sIPV 三價半成品所使用的配制容器是規(guī)格為 120 L 的不銹鋼儲運罐，根據(jù)前期驗證工作和三價半成品配制后抽樣數(shù)據(jù)，將 2 ～ 8 ℃ 條件下貯存 3、5 d 時的不銹鋼儲運罐裝三價半成品 D抗原回收率數(shù)據(jù)與相同條件下三個品牌一次性生物工藝袋的 D 抗原回收率數(shù)據(jù)共四組進行組間比較（表3），I 型、II 型、III 型 D 抗原回收率在組間差異不顯著（P＞ 0.05），因此三種品牌一次性生物工藝袋作為 sIPV 三價半成品的存儲容器與不銹鋼儲運罐相比，2 ～ 8 ℃ 暫存 5 d 內(nèi)對 D 抗原含量穩(wěn)定性的影響均無顯著性差異。

表3 裝有 sIPV 三價半成品的 3 種品牌一次性袋和不銹鋼儲運罐在 2 ～ 8 ℃ 下暫存 3、5 d 時 D 抗原回收率Table 3 Recovery rates of D antigen of final trivalent bulk of sIPV in three brands single-use bags or mobile tanks stored at 2 - 8℃ for 3/5d

3 討論

目前我所在生產(chǎn) sIPV 疫苗的過程中，中間產(chǎn)品 Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎 I 型、II 型、III 型單價原液使用 10 L 或 20 L 高硼硅玻璃容器儲存，保存條件 2 ～ 8 ℃ 下有效期 1年；三價半成品使用不銹鋼儲運罐儲存，暫存于 2 ～ 8 ℃ 下有效期 3 d。存儲容器按重復(fù)使用的模式進行管理，使用后及時清洗，每次使用前還須經(jīng)過純化水、注射用水清洗，組裝完畢后經(jīng)過保壓測試后進行濕熱滅菌，滅菌后使用前再進行保壓測試，測試通過后才能投入使用。整個過程步驟多且繁瑣，同時需要對所涉及的容器進行定期的清潔驗證和滅菌效果驗證，耗費較多人力物力。另外玻璃容器在轉(zhuǎn)運過程中有碎裂的風(fēng)險，一旦發(fā)生碎裂就會造成較大經(jīng)濟損失。

生物工藝袋出廠時經(jīng)過輻照滅菌和完整性測試，減少了傳統(tǒng)容器盛放中間產(chǎn)品所不可避免的清洗、滅菌、驗證等步驟所帶來的繁瑣操作，且為抽真空處理，使病毒原液或三價半成品存放在容器內(nèi)時殘留的空間達到最小限度，有效降低 pH 值的變化。生物工藝袋還可以訂制多個一次性連接管和多個一次性取樣袋，在溶液轉(zhuǎn)移或配制時無須開口操作，減少污染風(fēng)險，并且多個一次性取樣口使得取樣操作不需要在 A 級潔凈環(huán)境下進行，操作方便快捷。另外，生物工藝袋可選配自帶非接觸式磁力攪拌漿葉的混勻袋，相比不銹鋼儲運罐采用的間歇式通氣混勻模式而言，在配制或分裝過程中使溶液持續(xù)混勻的操作更為方便有效，且不會因為攪拌槳葉旋轉(zhuǎn)過程發(fā)生摩擦而脫落微粒[12]。

本研究中使用的三個品牌一次性生物工藝袋儲存 sIPV 單價原液，在 2 ～ 8 ℃ 下保存 15 個月，D 抗原回收率同使用 10 L 或 20 L 高硼硅玻璃瓶穩(wěn)定性數(shù)據(jù)相比，組間差異不顯著（P＞ 0.05），檢測結(jié)果均達到我所質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；三價半成品在（37 ±2）℃、相對濕度（75 ± 5）% 14 d 及（25 ± 2）℃、相對濕度（60 ± 5）% 保存至 6 個月的加速穩(wěn)定性考察實驗中，全部項目檢測結(jié)果均達到我所質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2 ～ 8 ℃ 保存至 24 個月的穩(wěn)定性考察實驗中，三個型 D 抗原含量仍符合質(zhì)量要求；各項檢測指標(biāo)均符合《中國藥典》三部（2015 版）相關(guān)要求。實驗結(jié)果說明長時間儲存疫苗時，三個品牌一次性生物工藝袋的接觸層對疫苗穩(wěn)定性均無顯著影響，原液及三價半成品可在儲液袋中長期穩(wěn)定保存。將各品牌一次性生物工藝袋三價半成品 D 抗原回收率與 sIPV 現(xiàn)使用的不銹鋼儲運罐穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進行比較，組間差異不顯著（P＞ 0.05），其余各項檢測結(jié)果均達到我所質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。使用一次性生物工藝袋能夠滿足生產(chǎn)工藝規(guī)程中的各項質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)數(shù)據(jù)可以為一次性生物工藝袋用于 sIPV 單價原液的儲存和三價半成品的配制及存儲提供支持。