吳 影，崔玉明，喬香君，王樂成，趙麗娜,2，馬金亮,3，古紹彬

(1 河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2 河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023；3食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023；4 鄭州航空港經(jīng)濟綜合實驗區(qū)綜合保稅區(qū)和口岸業(yè)務(wù)服務(wù)局，河南 鄭州 451162)

酒糟是白酒釀造過程中產(chǎn)生的固體廢棄物，2019年我國酒糟產(chǎn)量達5 640萬t[1]。酒糟具有較高的粗淀粉、粗纖維、粗灰分、粗蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，且酸度高易腐敗，處置不合理會造成嚴重的資源浪費和生態(tài)環(huán)境污染。目前，酒糟的再利用主要在動物飼料[2]、作物肥料[3]、活性炭[4]、沼氣生產(chǎn)[5]和有效成分提取[6]等方面，而作為動物飼料應用是酒糟利用價值最高的方式之一。目前酒糟飼料化利用主要有鮮酒糟直接飼用和微生物發(fā)酵后飼用等方式，但鮮酒糟因含水量高、酸度大，極易腐敗變質(zhì)等缺陷，且直接飼喂鮮酒糟易導致牲畜出現(xiàn)瘤胃酸中毒、酒精中毒和便秘等癥狀，因此鮮酒糟在牲畜飼糧中的應用受到一定的限制[7]。鮮酒糟經(jīng)微生物發(fā)酵后可有效改善其營養(yǎng)特性，延長保質(zhì)期，提高適用范圍[8]，然而目前在以酒糟為基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)動物飼料方面，仍以酵母發(fā)酵酒糟為主，且主要應用于反芻動物[9-10]，對于禽類也僅應用于蛋雞[11-12]，尚未見其他益生菌混合發(fā)酵酒糟生產(chǎn)動物活菌飼料及其在肉雞方面的應用研究報道?！讹暳咸砑觿┢贩N目錄(2013)》中允許添加的枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、釀酒酵母和植物乳桿菌，在改善機體免疫水平[13-14]、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境[15-16]、抑制與殺滅病原體[17]、提高胃腸道消化水平[18-21]和生長性能[22-25]、增加飼料適口性[26]等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究考察了多菌混合發(fā)酵制備的酒糟基復合益生菌劑對肉雞生長性能、屠宰性能、免疫器官指數(shù)、血清生化指標等的影響，旨在為酒糟的綜合應用和推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用酒糟發(fā)酵復合益生菌劑由河南科技大學微生物育種與代謝調(diào)控實驗室研制，發(fā)酵所用菌種為釀酒酵母(CICC1355)、枯草芽孢桿菌(CGMCC17305)、植物乳桿菌(HZLp-005)和凝結(jié)芽孢桿菌(CGMCC9951)，4種菌相互間無拮抗效應(圖1)。

C.凝結(jié)芽孢桿菌；L.植物乳桿菌；S.釀酒酵母；B枯草芽孢桿菌

酒糟基復合益生菌劑制備工藝：本地杜康白酒酒糟85%、玉米粉10%、尿素2.5%、磷酸二氫鉀1%，葡萄糖1.5%，加水至物料含水量60%～65%，pH值調(diào)至7，121 ℃滅菌20 min，冷卻后接種凝結(jié)芽孢桿菌(CGMCC9951)和釀酒酵母(CICC1355)，于35 ℃發(fā)酵2 d后，再接種植物乳桿菌(HZLp-005)和枯草芽孢桿菌(CGMCC17305)，繼續(xù)發(fā)酵3 d，4株菌的接種比例為1∶1∶1∶1，總接種量控制為10%(各菌種種子液濃度控制在108CFU/mL)。發(fā)酵后各菌株活菌數(shù)≥109CFU/g(含水量55%～60%)。經(jīng)平板稀釋計數(shù)法測定，制備的酒糟基復合益生菌劑在MRS培養(yǎng)基上的活菌數(shù)達5.4×1010CFU/g，采用《T/NAIA 060-2021飼料中真蛋白的測定-凱氏定氮法》測得真蛋白占比由發(fā)酵前的8.68%提高到15.2%，根據(jù)《GB/T 6434-2006飼料中粗纖維測定方法》測得粗纖維占比由發(fā)酵前的29.2%顯著降低為23.7%。發(fā)酵結(jié)果見圖2-B。

A.發(fā)酵前酒糟；B.發(fā)酵后酒糟

1.2 試驗動物及試驗設(shè)計

選取體質(zhì)量基本一致的1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞120只，隨機分成4組，每組3個重復，每個重復10只，公母各5只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗組Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分數(shù)1%，5%和10%的酒糟基復合益生菌劑，試驗期49 d。試驗基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表 1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗仔雞采用單層籠養(yǎng)方式，飼喂顆粒狀飼料，自由采食和飲水。試驗期間控制雞舍溫度，1～3 d控制在35 ℃，4～7 d控制在33 ℃，此后每周降2 ℃，降到26 ℃時保持恒溫；光照為1～3 d全天光照，此后每天23 h光照；空氣相對濕度一直保持在55%～60%。試驗雞舍做好衛(wèi)生處理，定時通風。飼養(yǎng)和免疫程序遵循常規(guī)進行。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能 試驗第21和第49天早晨以重復為單位稱量空腹12 h的肉雞體質(zhì)量，記錄試驗期間采食總量，計算試驗前期(1～21日齡)、后期(22～49日齡)和全期(1～49日齡)的平均日增重(ADG，g/d)、平均日采食量(ADFI，g/d)和料重比(F/G)。

平均日增重=(試驗結(jié)束時肉雞平均體質(zhì)量-試驗開始時肉雞平均體質(zhì)量)/試驗時間；

平均日采食量=總采食量/(試驗時間×雞數(shù))；

料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.4.2 屠宰性能 于試驗結(jié)束后禁食12 h，每個重復中隨機抽取接近平均體質(zhì)量的肉雞頸部放血處死，參照國家家禽育種委員會制定的《家禽生產(chǎn)性能指標名稱和計算方法》和李云龍等[27]所用方法測定試驗雞活體質(zhì)量、屠體質(zhì)量、半凈膛質(zhì)量、全凈膛質(zhì)量、胸肌質(zhì)量、腿肌質(zhì)量，計算屠宰率、全凈膛率、半凈膛率、胸肌率、腿肌率。

屠宰率=屠體質(zhì)量/活體質(zhì)量×100%；

全凈膛率=全凈膛質(zhì)量/活體質(zhì)量×100%；

半凈膛率=半凈膛質(zhì)量/活體質(zhì)量×100%；

胸肌率=兩側(cè)胸肌質(zhì)量/全凈膛質(zhì)量×100%；

腿肌率=兩側(cè)腿肌質(zhì)量/全凈膛質(zhì)量×100%。

1.4.3 免疫器官指數(shù) 于試驗結(jié)束當日，從每個重復中隨機抽取1只禁食12 h的肉雞稱質(zhì)量，頸動脈放血處死后立即無菌解剖，分離肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊，并分別稱其鮮質(zhì)量，計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)(mg/g)=免疫器官質(zhì)量(mg)/活體質(zhì)量(g)。

1.4.4 血清生化指標 分別于21和49日齡時，每個重復隨機選取1只接近平均體質(zhì)量的試驗雞，翅下靜脈采血1 mL，10 000 r/min離心10 min分離血清，嚴格按照試劑盒(深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)方法測定血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)含量和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性，計算球蛋白(GLB)含量。

球蛋白含量=總蛋白含量-白蛋白含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗測定結(jié)果以“平均值±標準差”表示。利用Excel 2010軟件對原始數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并進行多重比較，使用LSD法進行組間差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒糟基復合益生菌劑對肉雞生長性能的影響

酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對肉雞生長性能的影響見表2。

表2 酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對肉雞生長性能的影響

由表2可知，1～21日齡，各組肉雞平均日增重、平均日采食量、料重比和21日齡肉雞平均體質(zhì)量均無顯著差異(P>0.05)。22～49日齡，與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ組肉雞平均日采食量和平均日增重極顯著提高，其中平均日采食量分別提高7.52%和11.83%(P<0.01)，平均日增重分別提高16.58%和23.87%(P<0.01)；料重比則分別降低了7.97%和9.97%(P<0.05) ，顯著低于對照組。1～49日齡，與對照組相比，Ⅱ和Ⅲ組肉雞的平均日采食量和平均日增重均有極顯著提高，其中平均日采食量分別提高了5.22%和8.61%(P<0.01)，平均日增重分別提高13.90%和20.27%(P<0.01)；49日齡肉雞平均體質(zhì)量極顯著提高了13.31%和19.47%(P<0.01)，料重比降低7.89%和10.09%。

2.2 酒糟基復合益生菌劑對肉雞屠宰性能的影響

酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對肉雞屠宰性能的影響見表3。由表3可知，Ⅰ組和對照組肉雞各個指標均無顯著差異；Ⅱ和Ⅲ組肉雞半凈膛率、全凈膛率、腿肌率和胸肌率均顯著或極顯著高于對照組。與對照組相比，Ⅱ和Ⅲ組肉雞半凈膛率分別提高了3.43%和5.23% (P<0.05)，全凈膛率分別提高了5.66%和9.50% (P<0.05)，腿肌率分別提高了11.96%和28.60% (P<0.01)，胸肌率分別提高了11.49%和7.11% (P<0.01)。各組肉雞間屠宰率不存在顯著差異(P>0.05)。

表3 酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對肉雞屠宰性能的影響

2.3 酒糟基復合益生菌劑對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對肉雞免疫器官指數(shù)的影響見表4。由表4可知，Ⅰ組和對照組肉雞之間免疫器官指數(shù)無顯著差異，但當復合益生菌劑添加量達到5%及以上時，益生菌劑對促進肉雞免疫器官發(fā)育和成熟具有重要作用。與對照組相比，Ⅱ組肉雞的脾臟指數(shù)顯著提高了24.72%(P<0.05)，肝臟指數(shù)提高14.56%；Ⅱ和Ⅲ組肉雞的胸腺指數(shù)分別提高6.36%和6.78%；Ⅰ和Ⅱ組肉雞的法氏囊指數(shù)分別提高10.4%和20.81%，但均與對照組差異不顯著。

表4 酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.4 酒糟基復合益生菌劑對肉雞血清生化指標的影響

酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對肉雞血清生化指標的影響見表5。由表5可知， 21日齡時，與對照組相比，Ⅱ和Ⅲ組肉雞的白蛋白(ALB) 和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)顯著提高，其中ALB分別提高了18.39%和13.10% (P<0.05)，HDL-C分別提高18.92%和32.82%(P<0.05)；而尿酸(UA)則顯著降低了23.87%和36.41%(P<0.05)。49日齡時，與對照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組肉雞的ALT分別極顯著降低42.61%和61.11%(P<0.01)，ALB分別顯著提高20.65%和23.57%(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組肉雞的LDL-C分別降低20.06%，17.02%和12.46%(P=0.073)，但與對照組差異不顯著。其他血清指標各組之間不存在顯著差異性(P>0.05)。

表5 酒糟基復合益生菌劑不同添加水平對21和49日齡肉雞血清生化指標的影響

3 討 論

3.1 益生菌劑對肉雞生長性能的影響

益生菌能有效提升飼養(yǎng)動物的生長性能。郭王勇等[28]研究發(fā)現(xiàn)，采用由枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌組成的復合益生菌劑飼喂肉雞，能顯著提高日增重，降低料重比。唐志剛等[29]用以枯草芽孢桿菌為主包含地衣芽孢桿菌和乳酸桿菌的復合益生菌劑飼喂肉雞，結(jié)果表明該復合益生菌劑能極顯著提高肉雞前期的日增重和料重比。陳志敏等[30]研究表明，采用由植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌組成的混合菌劑飼喂肉雞，可使其日增重有增加的趨勢。本研究結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼糧中添加一定量的酒糟基復合益生菌劑(含釀酒酵母CICC1355、枯草樣芽孢桿菌CGMCC17305、植物乳桿菌HZLp-005和凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC9951)能顯著提高肉雞的平均日采食量、平均日增重，且可不同程度降低料重比。這主要是由于一部分益生菌以活菌形式進入動物腸道，通過靶位競爭和產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)參與腸道的微生態(tài)平衡調(diào)節(jié)；另一部分益生菌則以孢子形式進入動物腸道，并能在腸道內(nèi)快速萌發(fā)形成新的營養(yǎng)細胞，進而產(chǎn)生大量有助于飼料消化利用的水解酶，同時還可產(chǎn)生具有抑菌和防病作用的活性多肽等。因此酒糟基復合益生菌劑可通過對肉雞腸道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)控及營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率的增強，進而對肉雞的生長性能表現(xiàn)出明顯促進作用。

3.2 益生菌劑對肉雞屠宰性能的影響

屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腿肌率和胸肌率是評價肉用動物產(chǎn)肉性能的重要指標，可反映營養(yǎng)物在不同組織或同一組織不同位置的沉積量差異。黃金華等[31]研究表明，采用不同比例復合益生菌劑飼喂肉雞，均可顯著提高肉雞的半凈膛率和全凈膛率。本研究表明，基礎(chǔ)飼糧中添加適量的酒糟發(fā)酵復合益生菌劑，不僅能顯著提高肉雞的半凈膛率、全凈膛率，還能明顯增加腿肌率和胸肌率，而胸肌率和腿肌率是評價肉雞產(chǎn)肉性能及屠宰性能的關(guān)鍵指標。因此在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中適量添加酒糟基復合益生菌劑能顯著提高肉雞的屠宰性能。盡管益生菌對動物肉質(zhì)影響機制尚不清楚，但這可能與其參與了動物腸道菌群結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、肌內(nèi)脂肪沉積的增強、機體抗氧化能力的提升以及Ghrelin內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)等相關(guān)[32]。

3.3 益生菌劑對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、法氏囊和脾臟是肉雞最重要的免疫器官，其發(fā)育狀況以及功能強弱對機體免疫水平起著決定性作用，因此免疫器官指數(shù)被作為反映家禽機體免疫水平的最直接指標。劉克琳等[33]用益生菌飼喂肉雞, 能明顯觀察到微生態(tài)8901可顯著促進肉雞免疫器官的迅速生長和成熟。嚴濤等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中摻拌凝結(jié)芽孢桿菌飼喂白羽肉雞，能顯著提高其胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)。郭欣怡等[35]研究證實，乳酸菌、丁酸菌能提高肉雞的胸腺指數(shù)，且復合菌劑的效果優(yōu)于單菌。本研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼糧中添加一定量的酒糟發(fā)酵復合益生菌劑，能顯著提高肉雞的脾臟指數(shù)，并對肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也有一定的提升作用。這主要是益生菌的添加可促進肉雞前期免疫器官發(fā)育，刺激腸道免疫組織生長，增強肉雞體內(nèi)免疫功能，進而提升其對外界環(huán)境刺激及病原微生物侵染的抵抗能力，從而達到健康生長的目的。

3.4 益生菌劑對肉雞血清生化指標的影響

血液是聯(lián)系動物機體物質(zhì)代謝的主要場所，起到供給機體營養(yǎng)物質(zhì)，轉(zhuǎn)運代謝產(chǎn)物、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和消除傷害性刺激的作用。其中血清白蛋白(ALB)具有維持膠體滲透壓和體內(nèi)代謝物質(zhì)運輸及免疫、修復受損組織等生理功能，且血清中的ALB含量與動物生長速度呈正相關(guān)[35]。藍海恩等[36]研究表明，采用復合益生菌飼料代替10%日糧能顯著提高仔豬ALB含量。本試驗表明，在基礎(chǔ)飼糧中添加一定量的酒糟基復合益生菌劑可顯著增加肉雞的ALB含量，進而提高肝、腎代謝功能，促進肉雞的快速生長。同時，益生菌的攝入也有利于維護肉雞整個腸道菌群的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，提高腸道菌群的尿酸降解能力，進而導致肉雞血液中尿酸(AU)含量顯著降低。汪源泉[37]研究也發(fā)現(xiàn)，采用不同益生菌組合發(fā)酵的豆秸飼喂肉羊，均可降低其血清中UA含量。用益生菌干預治療原發(fā)性高尿酸血癥 C57BL/6小鼠，其血清中的尿酸水平呈顯著下降趨勢[38]。益生菌的攝入通常還可降低血清中的氨基轉(zhuǎn)移酶水平，Neag等[39]發(fā)現(xiàn)，預先給藥MegaSporeBioticTM可顯著降低血清氨基轉(zhuǎn)移酶水平(AST、ALT)。本研究也證實，添加適量的益生菌劑可有效降低肉雞血清中的ALT水平，這對保護肝臟活性具有重要作用。綜上，基礎(chǔ)飼糧中添加適量酒糟基復合菌劑不僅能增強肉雞的肝功能，還能提高肉雞的蛋白合成能力，進而促進蛋白在肉雞體內(nèi)轉(zhuǎn)化沉積和降低血清UA含量，以緩解腎臟壓力。

4 結(jié) 論

在基礎(chǔ)飼糧中添加質(zhì)量分數(shù)5%或10%酒糟發(fā)酵復合益生菌劑，可顯著提高肉雞平均日采食量，促進其免疫器官發(fā)育，刺激腸道免疫組織生長，提升其免疫功能，改善血液中的ALB、UA和ALT水平，提高肉雞合成蛋白的能力和肌內(nèi)脂肪沉積，進而增加飼料轉(zhuǎn)化效率、提高日增重、降低料重比。本試驗條件下，通過比較肉雞的生長性能、屠宰性能、免疫器官指數(shù)和血清生化指標，發(fā)現(xiàn)酒糟發(fā)酵復合益生菌劑在肉雞飼料中的最優(yōu)添加比例為10%。