劉來鑫，樊 圃

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點試驗室，北京 100005)

五羥色胺(5-Hydroxytrypatamine,5-HT)又稱血清素(serotonin)，是一種神經(jīng)遞質(zhì)，其生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，在哺乳動物中不僅參與認(rèn)知、社交、學(xué)習(xí)記憶、情緒、睡眠等多種生理過程[1-2]，也是胃腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子[3]。損傷或改變5-HT神經(jīng)傳遞會導(dǎo)致自閉、抑郁、焦慮、精神分裂等精神疾病[3]，一些治療抑郁、焦慮的藥物也會影響5-HT系統(tǒng)的活性[4]。L-色氨酸(L-tryptophan)是5-HT合成的重要底物，哺乳動物缺乏合成L-色氨酸所需的基因，因此L-色氨酸需要從低等生物中獲取[5]。L-色氨酸進入動物體內(nèi)后，在色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,Tph)催化下變成5-羥色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)，由于哺乳動物體內(nèi)Tph含量較少，因而這一過程是5-HT生物合成的限速步驟。目前已知哺乳動物體內(nèi)存在2種色氨酸羥化酶：色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase-1,Tph1)和色氨酸羥化酶2(tryptophan hydroxylase-2,Tph2),其中Tph2參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT的合成，而Tph1參與腸道和其他外周組織中5-HT的合成。由于5-HT不能通過血腦屏障，因而外周合成的5-HT無法進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6],這2個5-HT合成系統(tǒng)相互獨立。Tph2基因敲除會導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量降低，焦慮水平、社會行為等發(fā)生改變[7]，但尚未見Tph2基因敲除對大鼠行為影響的相關(guān)研究報道。與小鼠相比，大鼠具有更復(fù)雜的社會行為、認(rèn)知能力[8]。為此，本研究比較了雄性野生型(WT)大鼠和Tph2基因敲除型(Tph2KO)大鼠的體質(zhì)量、焦慮水平、社會行為、社會新奇認(rèn)知能力的差異，旨在為研究大腦中5-HT系統(tǒng)如何調(diào)控大鼠行為的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

通過CRISPR/Cas9方法構(gòu)建的基于SD背景的Tph2KO大鼠(第6外顯子(98 bp)及其前128 bp序列被敲除，形成移碼突變)由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院饒毅惠贈。為擴大種群將獲得的Tph2KO大鼠與購自維通利華的雄性野生型(WT)大鼠進行雜交擴繁3代以上，獲得的第4代大鼠建立封閉群(以非近親交配方式進行繁殖的一個種群)，封閉群中雜合子(Tph2+/-)大鼠交配獲得的Tph2KO大鼠與WT大鼠用于行為試驗。大鼠均在北京腦科學(xué)研究中心和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家蛋白質(zhì)中心動物房采用獨立通風(fēng)籠具進行飼養(yǎng)。

考慮到雄性動物無雌性動物周期性生理指標(biāo)的波動，因此本研究采用雄性大鼠進行行為試驗。出生的后代10 d左右剪腳趾進行編號，剪下的組織留作基因型鑒定，出生30 d后進行分籠。飼料和水充足供應(yīng)，飼養(yǎng)溫度恒定為25 ℃，相對濕度為40%～60%。每天中午12:00至次日凌晨0:00為暗周期。所有動物的飼養(yǎng)和使用均符合北京腦科學(xué)研究中心和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家蛋白質(zhì)中心動物倫理委員會的要求和規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

蛋白酶K(美國Millipore公司)，一步法基因分型裂解液(上海聽水生物科技有限公司)。Leica CM3050s冰凍切片機(德國Leica公司)，色譜柱(MicroSolv技術(shù)公司)，Vanquish Flex高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)，曠場試驗裝置、高架十字迷宮裝置、行為錄像軟件(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.3 Tph2KO大鼠的鑒定

取出生10 d左右雄大鼠的腳趾進行消化裂解，采用PCR方法對其進行鑒定。根據(jù)NCBI中的Tph2基因序列(GenBank ID:317675)，使用Primer 5.0設(shè)計引物，由睿博興科公司合成。Tph2引物序列為：F:5′-CCTCCCAAGGACAGACACAT-3′；R:5′-GGTGAGTGCCCCTTGTCTTA-3′。PCR反應(yīng)體系：組織裂解液0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taqmix 7.5 μL，ddH2O 1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性25 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖進行凝膠電泳。

1.4 Tph2基因敲除對大鼠體質(zhì)量和大腦中縫核5-HT含量的影響

1.4.1 對大鼠體質(zhì)量的影響 用電子秤稱取10周齡雄大鼠的體質(zhì)量，比較WT和Tph2KO大鼠體質(zhì)量的變化。

1.4.2 對大鼠大腦中縫核5-HT含量的影響 采用高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜檢測大鼠大腦中縫核(5-HT神經(jīng)元胞體聚集區(qū))5-HT的含量。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用甲醇稀釋5-HT標(biāo)準(zhǔn)儲備液，制備不同濃度(3，10，30，100，300，1000 nmol/μL)的5-HT標(biāo)準(zhǔn)溶液，取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL上樣進行高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜分析。條件為：色譜柱：Cogent diamond hydride column (MicroSolv，4 μm，150 mm×2.1 mm)；流動相：A相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈；液相梯度：0 min，90% B；1 min，90% B；16 min，30% B；18 min，30% B；20 min，90% B；25 min，90% B；上樣體積2 μL；柱溫35 ℃；流速0.4 mL/min。以標(biāo)準(zhǔn)液中5-HT濃度(nmol/μL)為橫坐標(biāo)(x)，以相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取WT和Tph2KO大鼠各3只，分別稱質(zhì)量，腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(劑量為40 mg/kg)麻醉，用4 ℃生理鹽水灌流將血液沖洗干凈；斷頭，迅速在4 ℃生理鹽水中分離出大鼠大腦中縫核核團，擦干表面水分稱質(zhì)量；腦組織用4 ℃、體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇勻漿(甲醇用量為1.5 mL/mg)，-20 ℃沉淀1 h，4 ℃下14 000 r/min離心10 min，取上清液進行高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜進行分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大鼠腦組織中5-HT含量。試驗以體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇為空白對照組。

1.5 Tph2基因敲除對大鼠行為的影響

1.5.1 曠場試驗 曠場試驗裝置由上海欣軟公司提供。將試驗大鼠置于曠場中心區(qū)域(設(shè)備中央50 cm×50 cm區(qū)域)，允許其自由探索15 min，用攝像機記錄其運動軌跡。利用軟件對所拍攝的視頻進行逐幀分析，統(tǒng)計試驗大鼠進入中心區(qū)域的時間和次數(shù)。

1.5.2 高架十字迷宮試驗 高架十字迷宮裝置(上海欣軟公司提供)是由2個開放臂和2個閉合臂從中央平臺伸出來組成。將試驗大鼠面向開放臂置于迷宮中央平臺，并允許其探索5 min，用攝像機記錄其運動軌跡。利用軟件對所拍攝的視頻進行逐幀分析，統(tǒng)計試驗大鼠進入開放臂和閉合臂的時間和次數(shù)。

1.5.3 強迫游泳試驗 為了解Tph2基因敲除是否會導(dǎo)致大鼠抑郁樣行為，采用強迫游泳行為范式檢測大鼠在試驗過程中靜止漂浮在水中的時間。靜止漂浮的時間越長，表明大鼠可能具有更高的抑郁程度。第1天預(yù)測試：在高50 cm直徑30 cm的透明塑料桶中注入約30 cm深的水(水溫≈室溫24 ℃)，確保大鼠在游泳或漂浮時后肢不接觸桶底，將試驗大鼠放入水中強迫游泳15 min。正式試驗在預(yù)測試24 h后進行，將試驗大鼠放入水中強迫游泳5 min，在水桶的側(cè)面架設(shè)攝像機進行拍攝，使用軟件對拍攝的強迫游泳視頻進行逐幀分析，統(tǒng)計試驗大鼠在5 min的強迫游泳時間內(nèi)靜止漂浮的時間。

1.5.4 位置偏好測試 三室試驗設(shè)備(100 cm×40 cm×30 cm)由北京功致斯美有機玻璃公司提供，有一個中央室和左右兩個側(cè)室，大鼠可通過中央室與側(cè)室間的開口自由進出。側(cè)室內(nèi)各有一個束縛器。將試驗大鼠放在中央室，讓其自由探索試驗場地10 min，用攝像機記錄大鼠探索的過程，利用軟件逐幀統(tǒng)計該階段試驗大鼠探索兩側(cè)室的時長。

1.5.5 社會互動測試 為測試Tph2基因敲除是否會導(dǎo)致大鼠社交能力的變化，采用三室試驗設(shè)備來檢測大鼠的社會性。將試驗大鼠引導(dǎo)至中央室，封鎖兩側(cè)室的入口。將1只陌生大鼠(Stranger 1)隨機放在某一側(cè)室的束縛器內(nèi)，打開全部側(cè)室入口。允許試驗大鼠自由探索10 min。用攝像機記錄其運動軌跡，利用軟件逐幀統(tǒng)計試驗大鼠進入Stranger 1所在側(cè)室以及空側(cè)室的時長。

1.5.6 社交新奇測試 通過社交新奇測試檢測Tph2基因敲除是否會導(dǎo)致大鼠的社會新奇認(rèn)知能力發(fā)生變化，社交新奇測試采用三室試驗設(shè)備，將試驗大鼠引導(dǎo)到中央室，封鎖兩側(cè)室的入口。將第2只陌生大鼠(Stranger 2)放置在另一側(cè)室。允許試驗大鼠自由探索三室10 min，用攝像機記錄其運動軌跡，利用軟件逐幀統(tǒng)計試驗大鼠進入Stranger 1和Stranger 2所在側(cè)室的時長和次數(shù)，探索新陌生鼠(Stranger 2)的時間越短表明大鼠的社會新奇認(rèn)知能力越低。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

使用軟件GraphPad Prism 7進行分析和作圖。使用 Kolmogorov-Smirnov normality test檢測數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布。對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用Student’sttest對兩組數(shù)據(jù)進行比較，用ANOVA對多組數(shù)據(jù)進行比較；對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用Mann-Whitney test對兩組數(shù)據(jù)進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tph2KO大鼠的鑒定

PCK鑒定結(jié)果(圖1)顯示，WT大鼠擴增出611 bp的Tph2基因，Tph2KO大鼠擴增出385(即611-98-128=385)bp的條帶，結(jié)果表明Tph2KO大鼠Tph2基因的第6外顯子(98 bp)及其前128 bp序列被成功敲除。

M.DNA Marker；1～2.Tph2KO 大鼠；3.WT 大鼠

2.2 Tph2基因敲除對Tph2KO大鼠體質(zhì)量和大腦中縫核5-HT含量的影響

10周齡時，WT大鼠的體質(zhì)量為317.9 g/只，Tph2KO大鼠的體質(zhì)量為235.9 g/只，極顯著低于WT大鼠(P<0.01)，表明Tph2基因敲除會導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量下降。

標(biāo)準(zhǔn)液中5-HT濃度(x)與相應(yīng)峰面積(y)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=452 340+809 615x，相關(guān)系數(shù)R2為0.994 7，在0～1 000 nmol/μL內(nèi)線性關(guān)系良好。

大鼠大腦中縫核 5-HT的含量如表1所示。由表1可知，WT雄大鼠大腦中縫核中5-HT含量為2 075.00 nmol/g，極顯著高于空白對照組(0 nmol/g)和Tph2KO雄大鼠(19.08 nmol/g)(P<0.01)，空白對照組與Tph2KO組無顯著差異(P>0.05)。這表明Tph2基因敲除會導(dǎo)致大鼠大腦中縫核5-HT含量顯著降低。

表1 大鼠大腦中縫核 5-HT的含量

2.3 Tph2基因敲除對大鼠焦慮水平的影響

在曠場試驗中，進入曠場中心區(qū)域的時間和次數(shù)越多表明大鼠的焦慮水平越低。曠場試驗結(jié)果(圖2)顯示，與WT雄大鼠(探索中心區(qū)域的時間為38.76 s，次數(shù)為9.90次)相比，Tph2KO雄大鼠探索中心區(qū)域的時間(30.00 s)和次數(shù)(6.50次)雖然表現(xiàn)出降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖2 Tph2基因敲除對大鼠探索曠場中心區(qū)域時間和次數(shù)的影響

高架十字迷宮試驗結(jié)果(圖3)顯示，Tph2KO雄大鼠探索開放臂的時間(69.89 s)和次數(shù)(5.40次)與WT雄大鼠探索開放臂的時間(66.25 s)和次數(shù)(4.30次)均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 Tph2基因敲除對大鼠抑郁樣行為的影響

強迫游泳試驗結(jié)果顯示，與WT雄大鼠靜止漂浮的時間(27.79 s)相比，Tph2KO雄大鼠靜止漂浮的時間(43.92 s)有升高的趨勢，但未達到顯著差異(P>0.05)。

2.5 Tph2基因敲除對大鼠社交能力的影響

Tph2基因敲除對大鼠位置偏好的影響如圖4所示。

圖4 Tph2基因敲除對大鼠位置偏好的影響

由圖4可知，WT雄大鼠探索左(254.60 s)右(252.80 s)兩側(cè)室的時長和Tph2KO雄大鼠(左238.2 s，右217.3 s)無顯著差異，未表現(xiàn)出明顯的位置偏好。

Tph2基因敲除對大鼠社會互動的影響如圖5所示。

圖柱上標(biāo)不同大寫字母表示同組差異極顯著(P<0.01)。圖6同

由圖5可知，WT雄鼠探索陌生大鼠1的時間(社會互動時間)為258.00 s，極顯著大于探索空室的時間(26.34 s)(P<0.01)；Tph2KO雄大鼠社會互動時間(224.00 s)也極顯著大于探索空室的時間(12.57 s)(P<0.01)，說明Tph2基因敲除不會影響大鼠的社交水平。

2.6 Tph2基因敲除對大鼠社會新奇認(rèn)知能力的影響

社交新奇測試結(jié)果(圖6和圖7)顯示，WT雄大鼠探索陌生大鼠2的時間(124.00 s)極顯著大于探索陌生大鼠1的時間(69.88 s)(P<0.01)，而Tph2KO雄大鼠探索陌生大鼠2的時間(73.92 s)與探索陌生大鼠1的時間(59.71 s)無顯著差異(P>0.05)，表明Tph2基因敲除導(dǎo)致大鼠的社會新奇認(rèn)知能力降低。Tph2KO雄大鼠探索陌生大鼠2的次數(shù)(14次)與其探索陌生大鼠1的次數(shù)(12.4次)無顯著差異，WT雄大鼠探索陌生大鼠2的次數(shù)(14次)也與其探索陌生大鼠1的次數(shù)(11.1次)無顯著差異，表明Tph2KO雄大鼠社會新奇認(rèn)知能力降低不是由于運動缺陷改變造成的。

圖6 Tph2基因敲除對大鼠社會互動時間的影響

3 討論與結(jié)論

Tph2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT合成的限速酶，特異性敲除大鼠Tph2基因后，大鼠大腦中縫核5-HT含量顯著減少，這與小鼠中報道的結(jié)果[9]一致。

本研究顯示，Tph2KO大鼠體質(zhì)量顯著低于野生大鼠，這與小鼠中報道的結(jié)果[10]一致。研究發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，Tph2KO小鼠的攝食量、脂肪質(zhì)量顯著減少，而能量消耗(耗氧量、總水平運動活動和產(chǎn)熱量)增加[10]。研究證實，小鼠腦內(nèi)的5-HT可通過5-HTR1a、5-HTR2b、5-HTR2c等受體來調(diào)節(jié)食欲和能量消耗[11-12]，因此，5-HT的缺失可能是導(dǎo)致Tph2KO大鼠體質(zhì)量降低的主要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，與WT大鼠相比，Tph2KO大鼠在曠場中心區(qū)域的探索時間和次數(shù)有明顯減少的趨勢，但未達到統(tǒng)計上的顯著差異，提示Tph2基因敲除可能會引起大鼠焦慮水平增加，這在Tph2KO小鼠上也有類似的報道[9]。有趣的是，5-HT再攝取轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，SERT)基因缺失的嚙齒動物因再攝取受損，中樞細胞外5-HT水平升高。SertKO小鼠[13-14]和大鼠[15]均表現(xiàn)出在曠場中心花費的時間減少等類似焦慮的癥狀和社交障礙[10]。此外，有研究將中縫核進行結(jié)構(gòu)劃分，認(rèn)為中縫核存在平行子系統(tǒng)，這些子系統(tǒng)在神經(jīng)投射、生理反應(yīng)屬性和行為功能上均存在差異[16]。條件敲除中縫核投射到眶額葉皮層的5-HT神經(jīng)元會導(dǎo)致焦慮水平增加，而條件敲除中縫核投射到中央杏仁核的5-HT神經(jīng)元會導(dǎo)致焦慮水平降低[16]。這種異質(zhì)性的存在提示，需要通過對大腦中的5-HT神經(jīng)元進行更精細的劃分，才能更好地了解大腦5-HT系統(tǒng)與焦慮水平之間的關(guān)系。

三室行為測試可以用于測試嚙齒動物的社交傾向。嚙齒動物通常喜歡花更多的時間探索同類，這一現(xiàn)象稱為社交性；同時還表現(xiàn)出與陌生同類互動的時間比與熟悉同類互動的時間長，稱為社交新奇性。本研究發(fā)現(xiàn)，Tph2基因敲除對大鼠的基本社交能力無顯著影響，但大鼠社會新奇性顯著降低，這種缺陷似乎不是由于探索活動改變造成的，可能是由于普遍的認(rèn)知功能障礙引起的[17]，因為Tph2KO大鼠進入兩側(cè)室的次數(shù)沒有差異，SertKO大鼠的研究結(jié)果[15]也支持這一結(jié)論。有研究表明，人類大腦內(nèi)側(cè)前額葉皮層與認(rèn)知記憶相關(guān)，而5-HT神經(jīng)元向內(nèi)側(cè)前額葉皮層發(fā)出廣泛投射，且5-HTR2a在內(nèi)側(cè)前額葉皮層中高度表達，與其功能相關(guān)[18]。人類發(fā)育過程中，5-HT受體表達的差異會影響前額葉皮質(zhì)內(nèi)相關(guān)神經(jīng)回路的活動和建立，如果5-HT系統(tǒng)功能在發(fā)育關(guān)鍵時間窗口被破壞，將導(dǎo)致前額葉皮層5-HT神經(jīng)元活動的改變，使得成年后的認(rèn)知和情緒行為受損[19]，另外，Tph2KO大鼠對新事物恐懼的增加也可能導(dǎo)致社會認(rèn)知能力降低[19-20]。

考慮到5-HT系統(tǒng)與抑郁癥存在相關(guān)性[21-22]，本研究采用強迫游泳試驗檢測大鼠靜止漂浮的時間。結(jié)果表明，與WT大鼠相比，Tph2KO大鼠未表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為，但靜止漂浮時間有增加的趨勢。與焦慮水平一樣，抑郁樣行為也受中縫核不同亞區(qū)的5-HT神經(jīng)元調(diào)控[16]，研究發(fā)現(xiàn)條件敲除中縫核-眶額葉皮層的5-HT神經(jīng)元會導(dǎo)致抑郁樣行為增加，而條件敲除中縫核-中央杏仁核的5-HT神經(jīng)元會導(dǎo)致抑郁樣行為減少[16]。因此，5-HT神經(jīng)元對抑郁樣行為的調(diào)控還需進一步探究。

綜上所述，Tph2基因敲除導(dǎo)致雄性大鼠大腦中縫核5-HT含量顯著減少，大鼠體質(zhì)量明顯降低，焦慮水平有增加的趨勢，社會新奇認(rèn)知能力降低。