楊彥君，丁 磊，馬 歡，吳云鋒

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

植原體(phytoplasma)是一種多態(tài)不規(guī)則且無(wú)細(xì)胞壁的單細(xì)胞原核生物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界由植原體引發(fā)的植物病害達(dá)800多種[1]，我國(guó)有100余種。我國(guó)對(duì)植原體病害的報(bào)道早在明末《沈氏農(nóng)書(shū)》中就有桑萎縮“凡桑一癃，再無(wú)醫(yī)法，斷不可留者”的記載[2]，植原體病害對(duì)經(jīng)濟(jì)林木以及農(nóng)作物造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。小麥藍(lán)矮植原體(WBD phytoplasma)是一種重要的糧食作物病害，引起植株矮化、叢枝增多、葉尖發(fā)黃，感病植株大多因不能正常抽穗而不結(jié)實(shí)，導(dǎo)致西北干旱麥區(qū)減產(chǎn)，發(fā)病較重的麥區(qū)產(chǎn)量損失可達(dá)到60%～80%，甚至絕收[3-6]。因此，對(duì)小麥藍(lán)矮植原體的致病機(jī)制、與寄主互作關(guān)系及其防控技術(shù)的研究至關(guān)重要。

隨著對(duì)細(xì)菌、真菌、線(xiàn)蟲(chóng)、卵菌、植原體分泌的效應(yīng)蛋白進(jìn)行廣泛研究，人們對(duì)病原物與寄主的互作有了更多的認(rèn)知[7]。例如稻瘟菌的效應(yīng)蛋白MoHrip2，通過(guò)促進(jìn)稻瘟菌的侵入以及侵入后的菌絲蔓延使其致病力提高[8]；禾谷鐮刀菌的效應(yīng)蛋白FgHrip1，可能作為信號(hào)分子激活小麥的水楊酸通路[9]等。農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期從小麥藍(lán)矮(WBD)植原體基因組中篩選發(fā)現(xiàn)，SWP16是植原體RNA沉默抑制子，能夠抑制寄主的RNA沉默防御系統(tǒng)[10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)植原體RNA沉默抑制子鑒定及其與寄主的互作蛋白均無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究以效應(yīng)蛋白SWP16為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從小麥cDNA文庫(kù)中篩選靶標(biāo)蛋白，探究WBD的互作蛋白，并運(yùn)用Uniprot對(duì)其進(jìn)行Gene Ontology(GO)注釋分析，該研究結(jié)果可為植原體病害防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥藍(lán)矮植原體病原以及所用載體，均由農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。小麥膜系統(tǒng)cDNA文庫(kù)由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王保通教授和李強(qiáng)副研究員惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘餌載體的構(gòu)建 根據(jù)小麥藍(lán)矮植原體SWP16的基因序列[11]設(shè)計(jì)帶有SfiⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物。提取感染小麥藍(lán)矮植原體病株的總DNA，PCR擴(kuò)增SWP16基因。PCR擴(kuò)增體系:cDNA 2 μL，2×Prime STAR Max 12.5 μL，上下游引物(100 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃變性10 s，退火15 s，退火溫度為引物(鏈解溫度(Tm)±3) ℃；72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增所用的引物序列為：SWP16-STE-F：AGCAATCTATTTTATGTAATggccattacggccA-TGATGAACACAAAAAGAA；SWP16-SUC-F：G-CATGCCAAAATATCTGCAATggccattacggccA-TGATGAACACAAAAAGAA；SWP16-STE/SUC-R：GATATCGAATTCCTGCAGATggccgaggcggc-cTTCTTTATTATATTATT。反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后通過(guò)同源重組的方法將目的基因SWP16構(gòu)建到2個(gè)誘餌載體pBT3STE和pBT3SUC上，分別命名為pBT3STE-SWP16和pBT3SUC-SWP16，通過(guò)引物對(duì)測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 最佳篩庫(kù)條件的確定 將以下6個(gè)組合：陽(yáng)性對(duì)照pTSU2-APP+pNubG-Fe65，陰性對(duì)照pTSU2-APP+pPR3-N，功能驗(yàn)證(判斷酵母是否能夠正常表達(dá)出融合蛋白)pBT3STE-SWP16+pOst1-NubI和pBT3SUC-SWP16+pOst1-NubI，自激活檢測(cè)(判斷誘餌蛋白是否會(huì)與空文庫(kù)質(zhì)?；プ?pBT3STE-SWP16+pPR3-N和pBT3SUC-SWP16+pPR3-N共轉(zhuǎn)進(jìn)酵母感受態(tài)菌株NMY51中，隨后將轉(zhuǎn)化物涂布在DDO(SD-Trp-Leu)和QDO(SD-Trp-Leu-His-Ade)固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)并觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。制作含0，5，10，15，20，25，30 mmol/L 3-AT的QDO平板，以O(shè)D600值為0.01時(shí)自激活酵母菌斑完全不生長(zhǎng)為最佳篩選條件。

1.2.3 小麥cDNA文庫(kù)的篩選與復(fù)篩驗(yàn)證 先將誘餌載體轉(zhuǎn)化到NMY51酵母菌中制備誘餌感受態(tài)，再將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入并分別涂布在加入適當(dāng)3-AT濃度的DDO(3個(gè))和QDO(40個(gè))選擇培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96 h，挑取單菌落重新在與篩庫(kù)條件相同的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)3次后依然生長(zhǎng)的克隆認(rèn)為陽(yáng)性克隆[12]。

1.2.4 二次互作驗(yàn)證 將獲得的陽(yáng)性克隆重新在QDO選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進(jìn)行α-半乳糖苷酶檢測(cè)(每100 mL培養(yǎng)基加入200 μL α-半乳糖苷酶,并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行避光培養(yǎng))。挑取顯藍(lán)菌斑使用裂解液處理，并用高保真酶RCP擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.1節(jié)。有擴(kuò)增條帶的送測(cè)序，無(wú)擴(kuò)增條帶的提質(zhì)粒后再測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 將上述測(cè)序結(jié)果在NCBI BLAST(http://blast.nbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行比對(duì)，得到的候選蛋白使用Uniprot進(jìn)行Gene Ontology(GO)注釋(http://www.uniprot.org)[13]，最后將所得結(jié)果在Excel 2020中整理匯總。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體的構(gòu)建

用小麥藍(lán)矮植原體總DNA為模板，擴(kuò)增得到210 bp的SWP16基因條帶，通過(guò)同源重組法連接至pBT3STE和pBT3SUC載體上(圖1)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)DNAMAN 9.01軟件比對(duì)序列無(wú)誤。

M.DL2000;1.SWP16;2.陰性對(duì)照;3.pBT3STE-SWP16;4.pBT3SUC-SWP16

2.2 最佳篩庫(kù)條件的確定

不同組合在DDO(SD-Trp-Leu)和QDO(SD-Trp-Leu-His-Ade)固體培養(yǎng)基平板上的生長(zhǎng)狀況如圖2所示。

圖2 誘餌蛋白的功能驗(yàn)證和自激活測(cè)試

由圖2可知，陽(yáng)性對(duì)照pTSU2-APP+pNubG-Fe65可以在DDO和QDO平板上正常生長(zhǎng)，陰性對(duì)照pTSU2-APP+pPR3-N不能在QDO上生長(zhǎng)，說(shuō)明酵母結(jié)構(gòu)功能可靠。為了驗(yàn)證誘餌蛋白是否可以在酵母體內(nèi)正常行使功能，將2個(gè)功能驗(yàn)證組合pBT3STE-SWP16+pOst1-NubI和pBT3SUC-SWP16+pOst1-NubI共轉(zhuǎn)進(jìn)酵母NMY51后，在DDO和QDO選擇性培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48～96 h，結(jié)果表明兩者均能在DDO和QDO培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，說(shuō)明pBT3STE-SWP16和pBT3SUC-SWP16都可以在酵母中正常表達(dá)出融合蛋白N-Cub-LexA-VP16，Cub與pOst1-NubI表達(dá)的NubI互作從而激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，使菌落在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且pBT3STE-SWP16活性更好。

2個(gè)自激活檢測(cè)組合pBT3STE-SWP16+pPR3-N和pBT3SUC-SWP16+pPR3-N均可在DDO培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，說(shuō)明共轉(zhuǎn)化成功；而在QDO選擇培養(yǎng)基上基本不生長(zhǎng)，說(shuō)明自激活活性較低，即誘餌蛋白基本不與空文庫(kù)質(zhì)?；プ鳎梢赃M(jìn)行篩庫(kù)試驗(yàn)。

綜合比較后發(fā)現(xiàn)，pBT3STE-SWP16在QDO選擇培養(yǎng)基上的功能活性更好且自激活活性較低，因此選擇pBT3STE-SWP16作為篩庫(kù)的誘餌蛋白，確定20 mmol/L 3-AT為篩選文庫(kù)的最佳濃度(圖3)。

圖3 20 mmol/L 3-AT 的QDO培養(yǎng)基

2.3 互作蛋白的篩選與二次驗(yàn)證

將誘餌載體pBT3STE-SWP16與小麥文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母NMY51后，涂布在40個(gè)含有20 mmol/L 3-AT的QDO平板上，28 ℃培養(yǎng)48～96 h后挑取單菌落重新在與篩庫(kù)條件相同的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行3次重復(fù)培養(yǎng)，對(duì)依然生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行α-半乳糖苷酶檢測(cè)，全部正常生長(zhǎng)且顯藍(lán)色(顯藍(lán)越明顯互作越強(qiáng)烈)。挑取顯藍(lán)菌斑使用裂解液處理后擴(kuò)增測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast分析整理，結(jié)果顯示從小麥文庫(kù)中共獲得20種互作蛋白(表1)，復(fù)篩驗(yàn)證和α-半乳糖苷酶檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示，20種候選蛋白全部與SWP16互作。

A.復(fù)篩驗(yàn)證;B.α-半乳糖苷酶檢測(cè)

表1 與SWP16互作的小麥文庫(kù)蛋白

2.4 生物信息學(xué)分析及通路預(yù)測(cè)

用Blast在小麥(Triticumaestivum)基因組中比對(duì)到20種互作蛋白基因，GO注釋分析表明,其中14種互作蛋白參與運(yùn)輸、pH調(diào)節(jié)、光合作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)泛素化等生理過(guò)程，剩余6種互作蛋白參與的生理過(guò)程未知；分子功能包括幾丁質(zhì)酶活性、反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、脫水酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等11類(lèi)；其中18種互作蛋白存在于6種細(xì)胞組分中，包括線(xiàn)粒體(1個(gè))、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(3個(gè))、細(xì)胞膜(7個(gè))、細(xì)胞質(zhì)(2個(gè))、葉綠體(4個(gè))、細(xì)胞壁(1個(gè))，另外2個(gè)候選蛋白定位未知(圖5)。

圖5 小麥互作蛋白的生物學(xué)信息分析

3 討 論

本研究以小麥藍(lán)矮植原體SWP16為誘餌，從小麥cDNA文庫(kù)中篩選到細(xì)胞色素b5、液泡膜相關(guān)蛋白，水解蛋白等20種互作蛋白。其中一部分是與光合作用相關(guān)的寄主蛋白，例如細(xì)胞色素B561、Rieske蛋白、PSI亞基Ⅴ、光系統(tǒng)Ⅱ蛋白D1等，其中細(xì)胞色素B561是一種負(fù)責(zé)電子傳遞的整膜蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗毒素防御反應(yīng)方面具有重要作用，并且能夠防止植物在干旱條件下由于過(guò)度光照而受損[14-15];對(duì)Rieske蛋白進(jìn)行基因沉默后，在擬南芥和煙草上都可以觀察到相似的褪綠、黃化、矮化，植株長(zhǎng)勢(shì)弱，發(fā)育遲緩等現(xiàn)象[16]；光系統(tǒng)Ⅱ蛋白D1的周轉(zhuǎn)可以緩解PSⅡ光抑制程度, 而抑制D1蛋白周轉(zhuǎn)可導(dǎo)致O3脅迫下植物葉片發(fā)生更加嚴(yán)重的光抑制[17]；PSI亞基Ⅴ影響植物光合作用的鐵離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性[18]。除此之外，Rieske 蛋白、光系統(tǒng)Ⅱ蛋白D1、BZIP還參與了光合作用中的光合電子傳遞、光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞途徑。研究認(rèn)為，植物受植原體侵染后與光合作用受阻密切相關(guān)，例如毛泡桐在患叢枝病后光系統(tǒng)Ⅱ葉綠素a/b結(jié)合蛋白表達(dá)量均下調(diào)[19]，在棗瘋病的研究中也發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵光合基因在感病品種中下調(diào)[20]，由此推斷SWP16與寄主蛋白互作可能影響小麥的光合作用。篩庫(kù)還獲得部分與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，比如細(xì)胞色素b5、CASP蛋白。其中細(xì)胞色素b5通過(guò)與cytP450以及cytc之間的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)微粒體單加氧酶中活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡[21-22]。因此，推測(cè)SWP16可能與細(xì)胞色素b5結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步促進(jìn)植原體侵染。另外，與SWP16互作的還有一些與逆境脅迫相關(guān)的蛋白，當(dāng)植物處于鹽脅迫條件下，V-ATPase顯示出高度的可塑性和靈敏性，對(duì)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用[23]；含Wali7結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在植物與金屬離子的耐受/解毒中起作用，參與植物的pH調(diào)節(jié)進(jìn)而影響植物發(fā)病[24]。除此之外，還得到了目前研究較少的一些蛋白質(zhì)，如DUF2012轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域蛋白、超長(zhǎng)鏈(3R)-3-羥?；?CoA脫水酶等，它們與植物的互作關(guān)系有待進(jìn)一步探究。

自從本實(shí)驗(yàn)室首次完成小麥藍(lán)矮植原體基因組測(cè)序[25]，先后鑒定出植原體叢枝效應(yīng)蛋白SWP1[26]、RNA沉默抑制子SWP16[10]和激發(fā)宿主防御反應(yīng)以及抑制壞死反應(yīng)的效應(yīng)蛋白[27]，極大推動(dòng)了植原體效應(yīng)蛋白的致病機(jī)理研究，提升了我國(guó)植原體領(lǐng)域的國(guó)際地位。本研究進(jìn)一步通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)篩選獲得了20種與小麥藍(lán)矮植原體效應(yīng)蛋白SWP16互作的蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了分析注釋?zhuān)兄谶M(jìn)一步推動(dòng)對(duì)小麥藍(lán)矮植原體病害的研究和防控。