惠靖茹，程洋洋，黃占旺

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，南昌 330045)

茶樹菇(Agrocybeaegerita)，又名茶新菇，是一種藥食兩用的真菌[1-2]?？诟写嗄矍逑悖兜栗r美[3]；營養(yǎng)極其豐富，其蛋白質(zhì)含量高達29.5%，含有多種人體必需氨基酸，以及多種B族維生素和礦物質(zhì)元素[4-5]。此外，茶樹菇具有抗衰老[6]，免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤[7]，改善心腦血管功能[8]等天然優(yōu)勢。目前茶樹菇主要分布在我國的福建、江西等地，江西省種植的茶樹菇產(chǎn)量在全國位居前列，但當(dāng)?shù)厥秤镁募庸ぜ夹g(shù)不夠成熟，大多為產(chǎn)品單一且附加值低的初級加工產(chǎn)品[9]。因此，利用茶樹菇和成曲發(fā)酵制成具有豐富營養(yǎng)物質(zhì)、口感鮮美的調(diào)味料，不僅可以提高茶樹菇的利用率而且使其深加工產(chǎn)品種類更加豐富。

米曲霉As3.042屬于黃曲霉群，菌落生長快，產(chǎn)孢能力強，可以更好適應(yīng)環(huán)境，是傳統(tǒng)釀造食品級醬料和醬油的生產(chǎn)菌種[10-11]。由于米曲霉As3.042是一種產(chǎn)復(fù)合酶的菌種[12]，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等[13]，其較高的酶活力可以更好地分解原料，且在一定程度上提高了醬類產(chǎn)品中的氨基酸態(tài)氮含量，進而更好地改善終產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤和口感[14]。

本文以米曲霉As3.042作為菌種，以糯米粉和黃豆粉作為菌種的營養(yǎng)物質(zhì)并通過恒溫恒濕培養(yǎng)得到成曲。以蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力作為評價指標(biāo)進行單因素試驗，對在制曲過程中的顯著影響因素即原料質(zhì)量比、潤水量和培養(yǎng)時間，依據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以成曲中蛋白酶活力為響應(yīng)值進行優(yōu)化試驗，得到最佳的制曲工藝，并對試驗結(jié)果進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

米曲霉As3.042：濟寧玉園生物科技有限公司；糯米：江西撫州荊公農(nóng)產(chǎn)品合作社；黃豆：贛州康瑞農(nóng)產(chǎn)品有限公司。

1.2 試劑

干酪素(生物試劑)、3,5-二硝基水楊酸試劑(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、福林酚：均為分析純，北京索萊寶科技有限公司；可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、葡萄糖：均為分析純，西隴化工股份有限公司；羧甲基纖維素鈉(化學(xué)純)：上海展云化工有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 揚州市三發(fā)電子有限公司；FA2004G電子天平 常州萬泰太平儀器有限公司；酶標(biāo)儀 Molecular Devices Corporation。

1.4 試驗方法

1.4.1 制曲工藝流程

糯米、黃豆→粉碎→過篩→干蒸→冷卻→接種→加入涼開水→拌勻→培養(yǎng)→成曲。

將原料粉碎過篩，置于蒸鍋中干蒸后，待糯米粉與黃豆粉于室溫下冷卻至40 ℃以下時，按照一定比例混合后接種米曲霉As3.042，拌勻。再加入一定量的涼開水拌勻后，置于托盤中壓平，切分成2 cm大小的方塊狀。放置霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，平均每間隔12 h翻曲1次，利于米曲霉As3.042均勻生長進而提高成曲品質(zhì)，直至制曲結(jié)束。

1.4.2 單因素試驗

設(shè)置原料質(zhì)量比(糯米粉∶黃豆粉)、接種量、潤水量、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度5個影響因素，不同原料質(zhì)量比(糯米粉的含量在原料總量中的占比為20%、40%、60%、80%、100%，即糯米粉∶黃豆粉為1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、5∶0)、不同米曲霉接種量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%)、不同潤水量(加水量在原料總量中的占比為35%、45%、55%、65%、75%)、不同培養(yǎng)時間(24，36，48，60，72 h)、不同培養(yǎng)溫度(22，26，30，34，38 ℃)。依據(jù)1.4.1中的工藝流程進行制曲后，再將其置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，以成曲中的蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力的大小為評價指標(biāo)，考察以上5個因素對制曲過程的影響，確定單因素的最佳取值范圍。每個試驗平行進行3次，取其測量結(jié)果的平均值。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

培養(yǎng)成曲所需原料的總質(zhì)量固定不變，原料質(zhì)量比即糯米粉與黃豆粉的質(zhì)量比，隨著糯米粉添加量的增多或減少，黃豆粉相應(yīng)地減少或增多。因此在響應(yīng)面試驗中，將原料質(zhì)量比因素改為糯米粉添加量，通過單因素試驗所篩選的條件，選擇糯米粉添加量(A)、潤水量(B)、培養(yǎng)時間(C)3個因素為影響因素，每個因素設(shè)置3個水平，以蛋白酶活力為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化并確定最佳制曲工藝條件。試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface optimization test

1.4.4 酶活力測定方法

中性蛋白酶活力的測定：參照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》中的福林酚法；水分含量的測定：采用國標(biāo)GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中水分的測定》中的常壓干燥法；淀粉酶活力和纖維素酶活力的測定：參考王海洋等[15]的方法。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析采用SPSS 25.0軟件，響應(yīng)面試驗設(shè)計、優(yōu)化分析采用Design-Expert 8.0.6軟件，繪圖處理采用OriginPro 2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 原料質(zhì)量比對成曲中酶活力的影響

以糯米粉作為淀粉質(zhì)原料，可為制曲時微生物的生長提供碳源，同時將黃豆粉作為蛋白質(zhì)原料，為制曲過程中微生物的生長提供氮源。當(dāng)具有充足的碳源和氮源時，微生物會迅速生長繁殖，代謝產(chǎn)物大大增加[16]。

圖1 原料質(zhì)量比對3種酶活力的影響Fig.1 The effect of raw material mass ratio on the activity of three enzymes

由圖1可知，淀粉酶活力在原料質(zhì)量比為2∶3時達到最大值，為255.95 U/g。而原料質(zhì)量比為3∶2時，蛋白酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別是4834.787, 17.1274 U/g。綜合考慮，選擇原料質(zhì)量比(糯米粉∶黃豆粉)3∶2為最佳水平。

2.1.2 接種量對成曲中酶活力的影響

當(dāng)接種量過小時，米曲霉對底物即原料利用不充分，導(dǎo)致酶活力較低；而隨著接種量的增加，原料中可利用的營養(yǎng)物質(zhì)不足以滿足米曲霉自身生長需要，使得其中部分微生物由于養(yǎng)分不足而生長緩慢，并影響了最終菌種孢子的成熟，其蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等酶系的分泌量也隨之減少，進而導(dǎo)致其酶活力降低[17]。王瑩[18]通過對米曲霉As3.042在醬油釀造中的性能檢測，發(fā)現(xiàn)米曲霉As3.042具有較高的蛋白酶活力，可以更好分解蛋白質(zhì)含量較多的原料，且采用米曲霉As3.042制曲時，其中的酯類物質(zhì)含量較高，醬油的酯香濃郁，香氣綿長飄逸。

由圖2可知，當(dāng)接種量為0.3%時，米曲霉生長所需的碳源和氮源充足，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4979.43, 244.87, 14.75 U/g。所以，接種量的最佳條件為0.3%。

圖2 米曲霉接種量對3種酶活力的影響Fig.2 The effect of Aspergillus oryzae inoculation amount on the activity of three enzymes

2.1.3 潤水量對成曲中酶活力的影響

在微生物的生長過程中，水不僅直接參與微生物的代謝反應(yīng)，還作為介質(zhì)存在其中。米曲霉通過孢子繁殖，而孢子在生長過程中需要吸入一定量的水分使其膨脹，有利于加快米曲霉的生長速度。此外，微生物代謝產(chǎn)物溶解到水中，才能通過細胞表面釋放出來。同時，當(dāng)基質(zhì)水分含量過高時，會造成基質(zhì)缺氧，不利于米曲霉生長[19]。

由圖3可知，隨著潤水量的增加，3種酶活力呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)潤水量達到55%時，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4696.97, 218.95, 20.10 U/g。因此，選擇55%為最佳潤水量。

圖3 潤水量對3種酶活力的影響Fig.3 The effect of water quantity on the activity of three enzymes

2.1.4 培養(yǎng)溫度對成曲中酶活力的影響

成曲中的酶活力具有高度的溫度依賴性。低溫對酶具有鈍化作用，會減緩微生物的生長及產(chǎn)物的代謝，降低酶活力；當(dāng)溫度超過38 ℃時，3種酶活力都趨于平緩，這是因為溫度過高不利于微生物的生長及代謝，甚至?xí)?dǎo)致酶失活。因此在制曲過程中，對培養(yǎng)溫度的選擇尤為重要[20]。

由圖4可知，當(dāng)溫度達到30 ℃時，蛋白酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4624.95, 14.00 U/g；而在34 ℃時，淀粉酶活力達到最大值，為247.70 U/g。綜合考慮，選擇30 ℃為最佳培養(yǎng)條件。

圖4 培養(yǎng)溫度對3種酶活力的影響Fig.4 The effect of cultivation temperature on the activity of three enzymes

2.1.5 培養(yǎng)時間對成曲中酶活力的影響

制曲時間對成曲的品質(zhì)有較大影響。當(dāng)制曲時間較短時，微生物不能充分生長，酶活力較小，成曲的風(fēng)味不足；而制曲時間過長，微生物進入衰亡期，會使其他雜菌生長，導(dǎo)致成曲中酶活力減小，影響發(fā)酵階段的產(chǎn)品品質(zhì)[21]。

由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)時間達到48 h時，成曲中蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4668.38, 217.30, 12.67 U/g。因此，以48 h作為最佳培養(yǎng)時間。

圖5 培養(yǎng)時間對3種酶活力的影響Fig.5 The effect of cultivation time on the activity of three enzymes

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果，固定米曲霉接種量0.3%、培養(yǎng)溫度30 ℃，篩選出對制曲過程影響較大的3個因素，即原料質(zhì)量比(A)、潤水量(B)和培養(yǎng)時間(C)，以蛋白酶活力(Y)為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

根據(jù)Box-Behnken中心復(fù)合設(shè)計原理，建立回歸方程預(yù)測模型，對響應(yīng)面試驗的結(jié)果進行多元線性回歸和二項擬合分析，得到回歸方程為： Y=5048.60+846.74A-363.33B-1.21C+48.35AB+27.79AC+44.41BC-1396.00A2-812.27B2-881.92C2。

2.2.2 模型方差分析

利用軟件Design-Expert 8.0.6建立模型，得到蛋白酶活力的多元二次回歸響應(yīng)面模型，對試驗結(jié)果進行多元線性回歸和二項擬合分析，以驗證回歸模型與因素的顯著性。方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The variance analysis of regression model

由表3可知，建立的回歸模型中F=72.01，P<0.0001，表明回歸模型的差異極顯著；而失擬項的P為0.5825>0.05，模型差異不顯著，表明該方程可靠；回歸系數(shù)R2=98.93%>85%，說明該方程擬合程度好，可用該回歸方程代替試驗真實點，來描述各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。校正系數(shù)RAdj2=0.9756，說明該模型可解釋97.56%蛋白酶活力的變化。表3中數(shù)據(jù)表明試驗設(shè)計可靠，誤差小，適合實際情況，可用來對茶樹菇發(fā)酵調(diào)味料的制曲試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。

由表3中P值可知,一次項中原料質(zhì)量比(A)和潤水量(B)對蛋白酶活力的影響極顯著，培養(yǎng)時間(C)的影響不顯著；二次項中A2、B2和C2對蛋白酶活力的影響均為極顯著；交互項中AB、AC、BC對蛋白酶活力的影響均為不顯著。參照表3中F值的大小可得出結(jié)論：3個因素對成曲中蛋白酶活力的影響程度為原料質(zhì)量比(A)>潤水量(B)>培養(yǎng)時間(C)。

2.2.3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

響應(yīng)曲面圖可以直觀地體現(xiàn)兩變量對因變量的影響情況，其坡度越陡峭，說明該試驗中的因變量對響應(yīng)值的影響越大，若曲面坡度越平緩，則影響越??；等高線圖呈橢圓形時，表明兩變量之間的交互作用越顯著，若等高線圖趨近圓形，則兩變量的交互作用幾乎可忽略[22]。利用響應(yīng)面回歸模型創(chuàng)建的原料質(zhì)量比、潤水量、培養(yǎng)時間的交互效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖見圖6。

a1

將其中一個因素固定，考察其他2個因素對響應(yīng)值的影響。由圖6中a1和a2可知，在固定因素培養(yǎng)時間(C)的情況下，隨著糯米粉添加量和潤水量的提高，蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢。在糯米粉含量為58.4%～73.9%，潤水量為47.8%～57.9%時，蛋白酶活力在較高范圍內(nèi)。由圖6中b1和b2可知，在固定因素潤水量(B)的情況下，隨著糯米粉添加量和培養(yǎng)時間的增加，蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢。在糯米粉添加量為59.3%～73.2%，培養(yǎng)時間為42.7～53.3 h時，蛋白酶活力處于較高水平。由圖6中c1和c2可知，在固定因素糯米粉添加量(A)的情況下，隨著潤水量和培養(yǎng)時間的增加，蛋白酶活力亦是先升高后降低的趨勢。在潤水量為49.7%～55.8%，培養(yǎng)時間為44.4～51.5 h時，蛋白酶活力較高。

2.2.4 驗證試驗

對回歸擬合方程進行求解，得出最佳制曲條件：A=66.13，B=52.85，C=47.98，此條件下，預(yù)測蛋白酶活力為5219.89 U/g。根據(jù)試驗和實際操作可行性，調(diào)整修正后的茶樹菇調(diào)味料制曲條件：糯米粉為66%，即原料比(糯米粉∶黃豆粉)為3.3∶1.7，接種量為0.3%，潤水量為52.9%，培養(yǎng)時間為48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

在此條件下進行驗證試驗，得到茶樹菇調(diào)味料成曲的蛋白酶活力為5118.16 U/g，同模型預(yù)測值的相對誤差僅為1.95%(<5%)，說明響應(yīng)面法對茶樹菇調(diào)味料制曲的工藝條件優(yōu)化所得到的生產(chǎn)工藝參數(shù)準確可靠，具有一定應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

調(diào)味料的科學(xué)調(diào)味營養(yǎng)化、多樣化和高檔化是未來調(diào)味料發(fā)展的趨勢。以蛋白酶活力、淀粉酶活力、纖維素酶活力的大小為指標(biāo)，通過單因素試驗，在所得結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化確定了茶樹菇發(fā)酵調(diào)味料的最優(yōu)制曲工藝：原料質(zhì)量比(黃豆粉∶糯米粉)為3.3∶1.7，接種量為0.3%，潤水量為52.9%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時間為48 h。在該條件下所制得成曲中的蛋白酶活力為5118.16 U/g，酶系含量較高，將其切為2 cm大小的方塊狀，表面與切面均長滿黃綠色孢子，具有成曲特殊的清香味，無雜菌生長。本研究可為用成曲與茶樹菇為原料制備發(fā)酵調(diào)味料的工藝研究提供一定的理論基礎(chǔ)，同時對發(fā)酵過程中相關(guān)理化指標(biāo)的檢測提供了科學(xué)的試驗依據(jù)。