劉麗娜，李順峰，魏書信，崔國梅，王安建，田廣瑞，周美如

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

香菇是我國第一大食用菌生產(chǎn)品種，不僅肉質(zhì)肥厚細(xì)嫩、滋味鮮美、香氣獨(dú)特，而且含有香菇多糖、有機(jī)堿、維生素、礦物質(zhì)等生物活性成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)、藥用和保健價(jià)值，是一種食藥同源的食品[1]。由于香菇含有豐富的呈味物質(zhì)，具有獨(dú)特的鮮美滋味，深受大眾的喜愛，已成為天然調(diào)味料研發(fā)的熱點(diǎn)。生物酶解技術(shù)是天然調(diào)味基料生產(chǎn)的常用方法，具有反應(yīng)條件溫和、耗能低、污染少、反應(yīng)定向可控等諸多優(yōu)點(diǎn)。采用酶解法對(duì)香菇進(jìn)行加工，可以將原料蛋白質(zhì)充分水解，釋放更多的風(fēng)味前體物質(zhì)，使其特殊風(fēng)味得到一定的增強(qiáng)。國內(nèi)外關(guān)于菌類酶解的研究也有一些報(bào)道，如LI Q等[2]研究發(fā)現(xiàn)，蘑菇湯經(jīng)過酶解預(yù)處理后蛋白質(zhì)、氨基酸等成分顯著增加；王雨生等[3]優(yōu)化了超聲波協(xié)同酶法制備香菇酶解液及其鮮味物質(zhì)的工藝；沈文鳳等[4-5]利用相應(yīng)的酶解技術(shù)制備了香菇調(diào)味料，吳關(guān)威[6]研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶酶解法釋放香菇柄中各滋味成分效果好于熱水浸提法。這些研究主要集中于酶解工藝方面，對(duì)于不同蛋白酶酶解特性對(duì)比的研究較少。目前，常用的商業(yè)蛋白酶主要有中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等，由于不同蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，對(duì)酶解液的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味有重要影響[3]，因此蛋白酶的選擇對(duì)酶解液的性質(zhì)至關(guān)重要。本研究采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)香菇粉進(jìn)行單酶酶解，研究不同蛋白酶對(duì)香菇酶解液的水解度、營(yíng)養(yǎng)成分、感官評(píng)價(jià)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，為香菇調(diào)味料的開發(fā)利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：購于西峽縣孫氏菌業(yè)專業(yè)合作社，50 ℃烘干粉碎過80目篩，取篩下物密封保存?zhèn)溆茫恢行缘鞍酌福富盍?.8 AU/g）、堿性蛋白酶（酶活力2.4 AU/g）、風(fēng)味蛋白酶（酶活力600 MG/g）：諾維信投資有限公司；甲醛、磷酸、乙醇、重蒸酚、濃硫酸、氫氧化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、酚酞等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP30002電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；FA2004C分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；HN-1000Y超聲波細(xì)胞破碎儀：上海汗諾軒儀器有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC-3018高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中加科學(xué)儀器有限公司；Advanced-I艾柯超純水機(jī)：臺(tái)灣艾柯成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XB-20B多功能粉碎機(jī)：上海兆申科技有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Supelco固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手柄、50 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）：美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香菇蛋白酶解液的制備

取適量香菇粉，按料液比1∶15（g∶mL）加入去離子水混合均勻，細(xì)胞破碎儀作用10min（超聲功率800W、頻率20kHz），分別添加一定量的蛋白酶，在一定條件下，酶解不同時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）后，沸水浴滅酶10 min后，4 000 r/min離心20 min，取上清液即為酶解液。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定各蛋白酶作用條件分別為中性蛋白酶添加量0.7%、溫度50 ℃、起始pH值自然，堿性蛋白酶添加量0.5%、溫度50 ℃、pH 8.5，風(fēng)味蛋白酶添加量0.7%、溫度50 ℃、起始pH值自然。

1.3.2 測(cè)定方法

（1）水解度的測(cè)定[7]

采用甲醛滴定法對(duì)酶解液水解度進(jìn)行測(cè)定，將酶解液4 000 r/min離心20 min，取上清液10 mL，蒸餾水60 mL于錐形瓶中，混勻，采用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴至pH=8.2，記下標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的體積，加入10 mL甲醛，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至pH=9.2，讀取0.1 mol/L氫氧化鈉溶液用量。同時(shí)，以蒸餾水代替待測(cè)樣品做試劑空白實(shí)驗(yàn)。水解度計(jì)算公式如下：

式中：C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1為樣液加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗氫氧化鈉的體積，mL；V2為空白組加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗氫氧化鈉的體積，mL；M為樣品的質(zhì)量，g；V為酶解上清液的體積，mL；8為每克蛋白質(zhì)所含的肽鍵的毫摩爾數(shù)，mmol/g。

（2）可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定[8]

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。

（3）多糖含量的測(cè)定[8]

采用苯酚-硫酸法對(duì)多糖進(jìn)行測(cè)定。

（4）感官評(píng)價(jià)

采用9分制對(duì)香菇酶解液從鮮味、苦味、香菇特征風(fēng)味三個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)定，隨機(jī)編號(hào)，由5名有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的評(píng)定人員按感官標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，最后評(píng)分取平均值，滿分為27分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 酶解液感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of hydrolysate

（5）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析[9]

SPME條件：取10 mL樣液放入40 mL萃取瓶中，蓋上瓶蓋在60 ℃水浴攪拌中平衡20 min后，用萃取頭吸附30 min，然后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣器中解吸5 min。

GC-MS條件：采用HP-5MS毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫起始溫度35 ℃保持5 min，5 ℃/min升溫至150 ℃，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃保持2 min，檢測(cè)器溫度：280℃。電離方式為電子電離（electronicionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)譜接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～550 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶處理對(duì)香菇酶解液的水解度的影響

不同的蛋白酶水解效果不同，與酶本身的性質(zhì)和底物的特點(diǎn)均有關(guān)系[10]。由圖1可知，經(jīng)過三種蛋白酶酶解處理后，香菇酶解液的水解度整體變化趨勢(shì)大致相同，酶解過程中隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)水解度先升高后降低，這可能是底物濃度不斷下降和終產(chǎn)物對(duì)酶的抑制持續(xù)加強(qiáng)的緣故[11]。風(fēng)味蛋白酶包含有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶等多種蛋白酶，作用位點(diǎn)廣泛，堿性蛋白酶和中性蛋白酶都是一種內(nèi)切蛋白酶，其選擇性相對(duì)風(fēng)味蛋白酶低[12]，因此相同酶解時(shí)間條件下，風(fēng)味蛋白酶大部分酶解過程中水解程度最高。堿性蛋白酶在3 h時(shí)率先達(dá)到最大水解度23.332%，之后趨于平穩(wěn)，整體水解程度明顯偏低；風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶在整個(gè)酶解過程中均保持相對(duì)較快的增加趨勢(shì)，分別在4 h、5 h達(dá)到最大水解度26.031%、25.709%，二者相差不大，均能達(dá)到較好的水解效果。

圖1 不同蛋白酶處理對(duì)香菇酶解液水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on hydrolysis degree of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate

2.2 不同酶處理對(duì)香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)含量、多糖含量的影響

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，不同酶處理的香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)和多糖含量變化趨勢(shì)基本相同，均是先不斷增加再緩慢減少。香菇蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶酶解處理后，生成小分子肽和氨基酸，可溶性蛋白質(zhì)含量增加[13]；同時(shí)，香菇多糖在結(jié)構(gòu)上易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)多糖，經(jīng)蛋白酶水解后，蛋白質(zhì)多糖被拆散，多糖被釋放出來，從而增加了多糖的含量[14]；因此，香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)和多糖含量的變化與圖1中水解度的變化趨勢(shì)一致。且堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶的酶解液同樣在酶解3 h、4 h、5 h的含量達(dá)到最大，其中風(fēng)味蛋白酶4 h酶解液可溶性蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到1.146 g/100 g；堿性蛋白酶3 h酶解液多糖含量最高，達(dá)到11.993 g/100 g。之后隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，可溶性蛋白質(zhì)含量略有減少，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的加熱，使得酶解液中的蛋白質(zhì)變性的緣故[15]。在酶解相同時(shí)間時(shí)，風(fēng)味蛋白酶大部分酶解過程中可溶性蛋白質(zhì)含量高于中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這與圖1中水解度的變化相對(duì)應(yīng)；而堿性蛋白酶在整個(gè)酶解過程中多糖含量始終保持最高，這可能與香菇多糖中部分堿溶性多糖在堿性反應(yīng)條件下逐漸溶解出來有關(guān)[4]。

圖2 不同蛋白酶處理對(duì)香菇酶解液可溶性蛋白質(zhì)（A）及多糖（B）含量的影響Fig.2 Effect of different proteases on the contents of soluble protein (A)and polysaccharide (B) of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate

2.3 香菇酶解液的感官評(píng)價(jià)

由表2可知，三種香菇蛋白酶解液的鮮味和香菇特征風(fēng)味都隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)得到了加強(qiáng)，堿性蛋白酶酶解3 h后、風(fēng)味蛋白酶酶解4 h后、中性蛋白酶酶解5 h后酶解液的鮮味和香菇特征風(fēng)味均出現(xiàn)不同程度的下降，這與酶解液水解度的變化趨勢(shì)類似，可能是因?yàn)椴煌牡鞍酌冈诿附膺^程中產(chǎn)生不同分子質(zhì)量的多肽，呈現(xiàn)出不同的感官風(fēng)味；后期感官評(píng)分降低可能與酶解產(chǎn)生的富含疏水性氨基酸的低分子質(zhì)量肽有關(guān)[16]。其中香菇特征風(fēng)味感官評(píng)分方面風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶最大值優(yōu)于中性蛋白酶，鮮味感官評(píng)分方面風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶最大值優(yōu)于堿性蛋白酶。三種香菇蛋白酶解液中，風(fēng)味蛋白酶苦味整體最弱；堿性蛋白酶的苦味最明顯，且隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)苦味加重，這表明酶解不僅能產(chǎn)生較多的呈味物質(zhì)，也會(huì)生成一些苦味物質(zhì)，這與沈文鳳等[17]的研究結(jié)果相一致。綜合來看，風(fēng)味蛋白酶酶解4 h時(shí)的酶解液感官評(píng)分最高，為22.80分；其次是中性蛋白酶酶解5 h的酶解液和堿性蛋白酶酶解3 h的酶解液，分別為22.10分、21.20分。

表2 不同蛋白酶處理的香菇酶解液感官評(píng)分結(jié)果Table 2 Sensory scoring results of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate with different proteases

2.4 香菇酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

由于整個(gè)酶解過程中堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶的酶解液分別在3 h、4 h、5 h具有較高的水解度和感官評(píng)價(jià)，因此，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行GC-MS分析，分離鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對(duì)含量見表3。

表3 不同蛋白酶處理的香菇酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析Table 3 Volatile flavor substances in Lentinus edodes enzymatic hydrolysate with different proteases by GC-MS

續(xù)表

由表3可知，香菇堿性蛋白酶解液共檢測(cè)出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類1種（0.60%）、含硫化合物5種（91.37%）、醛類10種（4.81%）、其他化合物（酮類、呋喃、酯類等）6種（3.22%）；香菇風(fēng)味蛋白酶解液共檢測(cè)出25種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類3種（0.75%）、含硫化合物6種（91.25%）、醛類11種（5.64%）、其他化合物（酮類、烴類、呋喃等）5種（2.36%）；香菇中性蛋白酶解液共檢測(cè)出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類1種（0.53%）、含硫化合物6種（91.33%）、醛類10種（5.02%）、其他化合物（酮類、烴類、酯類等）7種（3.12%）。很明顯，其中含硫化合物含量最高，醛類物質(zhì)種類最多。

許多研究表明[18-19]，含硫化合物是香菇特征香氣成分的主要物質(zhì)，是影響香菇特征風(fēng)味的關(guān)鍵組分，尤其可作為干香菇的主導(dǎo)性香氣物質(zhì)。三種香菇蛋白酶解液中相同的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共有19種，且含硫化合物的總相對(duì)含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，說明三種酶解液主要呈香物質(zhì)種類含量差別不大，差別更多體現(xiàn)在調(diào)和風(fēng)味的醛、酮、酯等物質(zhì)的差異方面。本實(shí)驗(yàn)中所用原料為干香菇，文獻(xiàn)中報(bào)道干香菇中含硫化合物達(dá)37.51%～62.09%[20-22]，而三種酶解液中含硫化合物含量均高達(dá)90%以上，對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大，說明香菇經(jīng)酶解后能釋放出更多的特征性風(fēng)味物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)在香菇酶解液中檢測(cè)到的含硫化合物主要為1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷（香菇素），這類硫雜環(huán)類化合物香氣強(qiáng)度大、香味閾值低、能有效改進(jìn)和增強(qiáng)香味特征[23]。三種硫雜環(huán)類化合物總相對(duì)含量為堿性蛋白酶解液（86.58%）＞風(fēng)味蛋白酶解液（86.49%）＞中性蛋白酶解液（83.39%），這與前面得到的香菇特征風(fēng)味感官評(píng)分結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)中二甲基二硫醚和二甲基三硫醚在三種酶解液中均未檢測(cè)出來，這可能與硫醚類物質(zhì)在聚合反應(yīng)中形成含硫雜環(huán)化合物（1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷）有關(guān)[24]。

八碳化合物也是香菇風(fēng)味成分的重要組成，代表性物質(zhì)如1-辛烯-3醇、3-辛醇、3-辛酮等[25]，本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)到1-辛烯-3醇，且含量不高，說明酶解處理使1-辛烯-3醇含量下降，可能是由于其熱穩(wěn)定性較差，產(chǎn)生氧化分解導(dǎo)致含量降低[26]，這與楊肖等[27]的研究結(jié)果相一致。三種酶解液中醇類物質(zhì)含量均不高，原因可能是醇類物質(zhì)在加熱時(shí)易揮發(fā)或易與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)。本次檢測(cè)中醛類物質(zhì)含量?jī)H次于含硫化合物，其中風(fēng)味蛋白酶相對(duì)含量最高，醛類物質(zhì)具有青草的風(fēng)味，主要包括己醛、苯甲醛、烯醛等，他們對(duì)氣味起著補(bǔ)充調(diào)和的作用[28]。此外，三種酶解液的風(fēng)味成分還有一部分來源于酯類、酮類、呋喃等化合物，本次實(shí)驗(yàn)中均有檢測(cè)到，他們對(duì)整體香氣有協(xié)調(diào)和互補(bǔ)的作用。所有這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同構(gòu)成香菇酶解液的特征風(fēng)味。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同蛋白酶的香菇酶解液的性質(zhì)進(jìn)行了比較分析，研究發(fā)現(xiàn)，三種酶解液的水解度隨著酶解時(shí)間的增加先升高后慢慢降低，整體變化趨勢(shì)大致相同，其中風(fēng)味蛋白酶酶解4 h的酶解液水解度最高，達(dá)到26.031%；酶解液的可溶性蛋白質(zhì)含量、多糖含量及鮮味和香菇特征風(fēng)味在酶解過程中的變化與水解度類似，其中風(fēng)味蛋白酶酶解液可溶性蛋白質(zhì)含量較高、苦味整體最弱，堿性蛋白酶酶解液多糖含量較高、苦味最明顯，風(fēng)味蛋白酶酶解4 h的酶解液感官評(píng)分最高為22.80分；其次是中性蛋白酶酶解5 h的酶解液（22.10分）和堿性蛋白酶酶解3 h的酶解液（21.20分）。

采用GC-MS對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，三種香菇酶解液中風(fēng)味蛋白酶解液共檢測(cè)出25種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，高于堿性蛋白酶和中性蛋白酶；三種酶解液中含硫化合物總相對(duì)含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，均高達(dá)90%以上，對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大，說明香菇經(jīng)酶解后能釋放出更多的特征性風(fēng)味物質(zhì)。1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷這三種硫雜環(huán)類化合物總相對(duì)含量堿性蛋白酶解液（86.58%）＞風(fēng)味蛋白酶解液（86.49%）＞中性蛋白酶解液（83.39%），與香菇特征風(fēng)味感官評(píng)分結(jié)果相一致。三種酶解液中醛類物質(zhì)種類最多，含量?jī)H次于含硫化合物，其中風(fēng)味蛋白酶解液中醛類物質(zhì)相對(duì)含量最高。綜合來看，風(fēng)味蛋白酶香菇酶解液具有更高的水解度、可溶性蛋白質(zhì)含量、多糖含量和更好的整體風(fēng)味。