楊嘉妮 朱星枚 袁盼盼 郭凱麗 薛 妙 劉繼平 王 川 王 斌

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng) 712046

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%[1]?；熂鞍邢蛑委熡行?，但易復(fù)發(fā)、易耐藥[2-3]。黃精可治療食管癌、胃癌、直腸癌、肺癌等惡性腫瘤[4-5]，協(xié)同化療或靶向藥物治療NSCLC 時(shí)，能顯著改善患者生活質(zhì)量、臨床療效和卡諾夫斯凱計(jì)分評(píng)分，并減輕毒性，延緩耐藥[6]，黃精抗NSCLC 作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制需進(jìn)一步討論。黃精成分多樣，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)豐富，具有不確定性，僅依靠傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法很難確定其藥效成分及作用機(jī)制[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)構(gòu)建生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)與分析，可解釋藥物多組分的協(xié)同作用[8-9]。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究黃精治療NSCLC的有效成分及分子機(jī)制，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)及體外實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

人NSCLC 細(xì)胞系A(chǔ)549 購(gòu)自武漢普諾賽。3’-甲氧基大豆苷元（B31005）、黃芩素（C07M10Y87479）、甘草素（C15H1204）購(gòu)自上海源葉；順鉑（C19PA3741B）購(gòu)自北京普西唐；CCK-8（EG20201111）購(gòu)自南京恩晶；Annexin V-FITC/PI（556547）購(gòu)自BD Pharmingen。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（TY2021000834）購(gòu)自美國(guó)伯騰；流式細(xì)胞儀（Epics XL-MCL）購(gòu)自BECKMAN COULTER。

1.2 黃精活性成分與疾病靶點(diǎn)收集

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）獲得黃精活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，口服利用度≥30%，類(lèi)藥性≥0.18。檢索人類(lèi)基因注釋、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳和治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)收集NSCLC靶點(diǎn)。Version 2.1.0 繪制黃精與NSCLC 交集靶點(diǎn)。

1.3 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將交集靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，富集結(jié)果通過(guò)柱狀圖和氣泡圖呈現(xiàn)。

1.4 分子對(duì)接驗(yàn)證

使用Cytoscape3.6.1 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，Network Analyzer 插件篩選黃精抗NSCLC 核心成分（degree≥5）與核心蛋白，利用AutoDock 4.2 進(jìn)行分子對(duì)接，借助Pymol 實(shí)現(xiàn)可視化。

1.5 CCK-8 檢測(cè)藥物抗A549 細(xì)胞增殖能力

給予A549 細(xì)胞不同濃度的黃精黃酮類(lèi)核心成分[3'-甲氧基大豆苷元（0、2.22、8.88、3.55×101、1.42×102、5.68×102μg/ml）、黃芩素（0、2.03、4.05、8.10、1.62×101、3.24×101μg/ml）、甘草素（0、6.4、1.28×101、2.56×101、1.024×102、2.048×102μg/ml）][10-12]處理48 h，每孔加入10 μl 的CCK8 溶液，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)3.5 h，讀取450 nm 吸光值（OD），細(xì)胞生存率=[（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）]×100%。每組藥設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，每種藥IC50重復(fù)測(cè)定5 次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力

給予A549 細(xì)胞不同濃度黃精黃酮類(lèi)核心成分（8.1×101、1.62×102、3.24×102、6.48×102μg/ml）[13]處理48 h，消化、離心后加5 μl Annexin V-FITC 和PI，混勻，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃精活性成分及疾病靶點(diǎn)

TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲12 個(gè)黃精活性成分和85 個(gè)相應(yīng)靶點(diǎn)，與1693 個(gè)NSCLC 靶點(diǎn)交集得到43 個(gè)共有靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。靶點(diǎn)映射得8 個(gè)有效成分，即3’-甲氧基大豆苷元、黃芩素、甘草素、5，4’-二羥基黃酮、（2R）-7-羥基-2-（4-羥基苯基）-4-黃酮、谷甾醇、β-谷甾醇和薯蕷皂苷。

2.2 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集分析顯示，生物過(guò)程以RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、炎癥反應(yīng)、胚胎植入為主；細(xì)胞組成以細(xì)胞核、細(xì)胞溶質(zhì)、線(xiàn)粒體為主；分子功能主要富集到序列特異性DNA 結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體作用、血紅素結(jié)合等功能上。繪制排名前5 的GO 富集分析結(jié)果見(jiàn)圖2；排名前20 的KEGG 通路見(jiàn)圖3，涉及癌癥、細(xì)胞凋亡、低氧誘導(dǎo)因子-1、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等通路。

2.3 分子對(duì)接驗(yàn)證

黃精抗NSCLC 核心成分主要是黃酮類(lèi)成分：黃芩素（degree=34）、3’-三甲氧基大豆苷元（degree=17）、甘草素（degree=10）和5，4’-二羥基黃酮（degree=6）。對(duì)應(yīng)7 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)：二羥基黃酮與TP53、AKT 激酶、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶-3、雄激素受體和低氧誘導(dǎo)因子1A。分子對(duì)接展示對(duì)接結(jié)合能最低者（圖4），對(duì)接結(jié)合能均＜-7.5 kcal/mol（表1），說(shuō)明配體與受體結(jié)合穩(wěn)健。

表1 黃精中黃酮類(lèi)化合物與主要靶點(diǎn)對(duì)接參數(shù)及相應(yīng)計(jì)算結(jié)果

2.4 不同黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)A549 細(xì)胞的IC50

不同濃度3’-甲氧基大豆苷元、黃芩素、甘草素處理A549 細(xì)胞48 h，3’-三甲氧基大豆苷元、黃芩素、甘草素IC50分別是6.88×10、7.99 和4.34×10 μg/ml。表明黃精黃酮（5，4’-二羥基黃酮因溶解性差，未進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證）對(duì)A549 細(xì)胞有較強(qiáng)的抗增殖能力。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定黃芩素誘導(dǎo)A549 凋亡作用

黃精中黃芩素抗NSCLC 作用明顯，故流式細(xì)胞術(shù)選擇研究黃芩素誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡作用，見(jiàn)圖5。高劑量黃芩素（8.1×10、1.62×102、3.24×102、6.48×102μg/ml）作用A549 細(xì)胞48 h 后，給藥組（圖5b～5e）凋亡率高于陽(yáng)性對(duì)照組（順鉑）（圖5f），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

3 討論

黃精為我國(guó)著名藥食兩用藥材，具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[14-16]。本文篩選出黃精抗NSCLC 潛在活性成分與張嬌等[17]綜述的黃精中黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)一致，該類(lèi)成分被證實(shí)具有抗腫瘤增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤遷移的能力[18-20]。TP53 是重要的抑癌基因[21]，AKT 過(guò)度活化促進(jìn)NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[22-24]。分子對(duì)接顯示黃芩素、3’-三甲氧基大豆苷元、甘草素、5，4’-二羥基黃酮均與TP53、AKT 具有較好的結(jié)合能力，黃精具備多點(diǎn)靶向TP53、AKT 的潛力。B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶-3 則是腫瘤中的凋亡因子[25-27]，黃精中黃酮組分可以通過(guò)活化B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶-3，誘導(dǎo)NSCLC 細(xì)胞凋亡，與化療藥物發(fā)揮協(xié)同作用。本文以細(xì)胞毒性最強(qiáng)的黃芩素為例，通過(guò)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高劑量黃芩素可以誘導(dǎo)A549 凋亡，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)一致，進(jìn)一步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的可靠性。實(shí)驗(yàn)中亦嘗試應(yīng)用低劑量黃芩素作用A549，其誘導(dǎo)凋亡作用不明顯。

總之，本文首次通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了黃精抗NSCLC 的物質(zhì)基礎(chǔ)及可能作用靶點(diǎn)。提出黃精中4 個(gè)黃酮類(lèi)物質(zhì)可以與NSCLC 相關(guān)的7 個(gè)靶點(diǎn)緊密結(jié)合發(fā)揮抗NSCLC 作用，具有潛在的抗NSCLC 增殖、誘導(dǎo)NSCLC 凋亡的藥理作用。亦為臨床合理應(yīng)用黃精協(xié)同化療藥物治療NSCLC 提供了新的思路。