邢琪昌 陳 佳 劉 征 李 偉 劉 湘

湖南省湘潭市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖南湘潭 411100

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是一種糖尿病引起的神經(jīng)功能障礙相關(guān)疾病，臨床癥狀包括疼痛、麻木、蟲(chóng)爬、發(fā)熱等，多發(fā)于下肢，是引起糖尿病足甚至截肢的危險(xiǎn)因素[1-2]?！锻跣窀哚t(yī)案》中云：“消渴日久，但見(jiàn)手足麻木，肢涼如冰，四肢痿弱乏力”，描述的消渴痹癥的臨床表現(xiàn)與DPN 屬同一范疇[3]。本研究通過(guò)收集當(dāng)代中醫(yī)治療DPN 的內(nèi)服方藥，分析其用藥規(guī)律，并對(duì)核心藥對(duì)的作用機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)，以期為臨床治療DPN 提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以“糖尿病周圍神經(jīng)病變”“DPN”“消渴痹癥”“痹證”“絡(luò)病”等為關(guān)鍵詞，檢索中國(guó)知網(wǎng)（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）2009 年1 月1 日 至2020 年9 月30 日相關(guān)文獻(xiàn)，搜集論述完整、方劑處方清晰、遵循中醫(yī)辨證思想、具有臨床療效的中藥內(nèi)服治療DPN 的臨床報(bào)道。

1.2 研究方法

1.2.1 數(shù)據(jù)規(guī)范 根據(jù)《中藥大辭典》[4]和《中藥學(xué)》[5]（十二五教材）處方中中藥名進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范整理，例如把枸杞子統(tǒng)計(jì)為枸杞，土元統(tǒng)計(jì)為土鱉蟲(chóng)等。將收集好的437 首處方藥物依次錄入Excel 模版，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 ①使用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)（V3.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別統(tǒng)計(jì)分析藥物使用頻次、藥物功效及組方規(guī)律，獲得核心藥對(duì)；②通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索核心藥對(duì)的所有化學(xué)成分，并對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)；③在DrugBank、TTD 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索收集DPN 相關(guān)疾病靶點(diǎn)；④將上述藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，作為核心藥對(duì)干預(yù)DPN 的作用靶點(diǎn)；⑤將上述作用靶點(diǎn)上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行KEGG 和GO 富集分析。方法步驟參考文獻(xiàn)[6-7]。

1.2.3 分子對(duì)接驗(yàn)證 從Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物3D 結(jié)構(gòu)（SDF 格式文件），從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)（pdb 格式文件），使用PyMOL 軟件對(duì)化合物和蛋白進(jìn)行去水、加氫處理，然后通過(guò)AutoDock VINA 1.1.2（No registration required）軟件將化合物與靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能，并展示結(jié)合構(gòu)型，步驟參考文獻(xiàn)[8-9]。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1.1 藥物功效統(tǒng)計(jì)分析 在干預(yù)DPN 的437 首中藥方劑中共應(yīng)用中藥204 味，出現(xiàn)頻次共4550 次。應(yīng)用最多的依次為補(bǔ)虛類、活血化瘀類和解表類等中藥。見(jiàn)圖1。

2.1.2 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的藥物組合使用統(tǒng)計(jì)分析 組方用藥規(guī)律以規(guī)則分析為核心處理算法，設(shè)置支持個(gè)數(shù)為100（表示所有藥物中同時(shí)出現(xiàn)的個(gè)數(shù)），置信度0.7，點(diǎn)擊“用藥模式”，展示前15 組支持度較高藥對(duì)，其中黃芪-當(dāng)歸組合支持度最高，故將其選為核心藥對(duì)，用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。見(jiàn)圖2。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果

2.2.1 核心藥對(duì)成分靶點(diǎn)圖構(gòu)建 檢索獲得黃芪-當(dāng)歸中212 個(gè)化合物對(duì)應(yīng)作用244 個(gè)靶點(diǎn)，并收集DPN 相關(guān)靶點(diǎn)148 個(gè)，兩者取交集，獲得黃芪-當(dāng)歸干預(yù)DPN 作用靶點(diǎn)33 個(gè)，Degree 值較高的化合物分別為MOL00 0098（槲皮素）、MOL000206（異丁香酚）等。見(jiàn)圖3。

2.2.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及KEGG 通路富集分析 將上述33 個(gè)共同靶點(diǎn)基因輸入至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PPI 圖（圖4），Degree 值較高的靶點(diǎn)有SLC6A4、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等；KEGG 與GO 富集分析結(jié)果見(jiàn)圖5～6，通路主要有神經(jīng)活性配體受體交互作用、鈣離子信號(hào)通路等，GO 分析富集得到140 個(gè)生物過(guò)程，包含刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)等，18 個(gè)細(xì)胞組成包括細(xì)胞膜、內(nèi)膜系統(tǒng)等，以及25 個(gè)細(xì)胞功能包括蛋白結(jié)合、分子傳導(dǎo)活性等。

2.3 分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇“2.2.1”結(jié)果中成分作為核心成分；選取IL-6和SLC6A4 作為分子對(duì)接的靶點(diǎn)蛋白。分子對(duì)接結(jié)果顯示核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均＜-5.0 kcal/mol，具有較好的親和力和結(jié)合活性。見(jiàn)表1。

表1 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

DPN 是一種最為常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，約有50%以上1型或2型糖尿病患者患有DPN[10]。目前西醫(yī)對(duì)DPN 的治療除了控制血糖外，還包括抗氧化應(yīng)激、改善代謝紊亂、改善微循環(huán)等對(duì)癥治療[11]。但DPN 致病因素復(fù)雜，復(fù)發(fā)率高，仍需積極尋找針對(duì)治療DPN 的新手段和新藥物。

中醫(yī)藥治療“消渴痹癥”“絡(luò)病”“痹癥”等疾病歷史悠久，近現(xiàn)代亦有豐富的文獻(xiàn)記載。本研究通過(guò)對(duì)近10 年當(dāng)代中醫(yī)運(yùn)用中藥方劑內(nèi)服治療DPN 的文獻(xiàn)進(jìn)行收集整理，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)虛類藥物應(yīng)用最多，其次是活血化瘀藥，體現(xiàn)中醫(yī)治療DPN 扶正祛邪的基本原則。黃芪和當(dāng)歸分別為補(bǔ)氣與補(bǔ)血活血的要藥。研究顯示，黃芪在降血脂、降血糖和減少糖尿病并發(fā)癥等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12-13]。當(dāng)歸藥理作用主要體現(xiàn)在促進(jìn)造血細(xì)胞分化和增殖及抑制微炎癥[14]，但也有研究顯示當(dāng)歸中某些成分能夠上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子，從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)的作用[15]。

中醫(yī)藥治療疾病作用機(jī)制常常難以闡釋。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)高頻核心藥對(duì)黃芪-當(dāng)歸的潛在作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)?；衔锖Y選方面，槲皮素和異丁香酚在神經(jīng)保護(hù)方面具有重要作用。槲皮素是一種常見(jiàn)的黃酮類化合物，具有強(qiáng)抗氧化和清除自由基作用[16]。Xie 等[17]研究顯示槲皮素能夠改善STZ 誘導(dǎo)的DPN 大鼠周圍神經(jīng)損傷，其機(jī)制與調(diào)節(jié)DPN 表型相關(guān)的腸道菌群和活性氧表達(dá)水平有關(guān)。也有體外研究顯示，槲皮素可以通過(guò)增加自噬以促進(jìn)RSC96 細(xì)胞的增殖、減少凋亡，從而減輕高濃葡萄糖的損傷[18]。異丁香酚屬于當(dāng)歸揮發(fā)油中主要成分之一，有報(bào)道稱其對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病變具有保護(hù)作用，機(jī)制與減弱坐骨神經(jīng)區(qū)域氧化應(yīng)激標(biāo)志物和谷胱甘肽水平有關(guān)[19]。IL-6 參與IL-17 和TNF 等炎癥通路和糖基化終末產(chǎn)物-受體信號(hào)通路，這些靶點(diǎn)和通路在DPN 的發(fā)生發(fā)展中都扮演了重要角色[20]，有研究顯示，IL-6水平升高與痛性DPN 的發(fā)生相關(guān)[21-22]，SLC6A4 是一種5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，存在于神經(jīng)突出前膜，將突觸間隙5-羥色胺回吸收至突觸前神經(jīng)元囊泡，調(diào)節(jié)突觸間隙5-羥色胺數(shù)量，進(jìn)而影響突觸后膜5-羥色胺受體活性及突觸間信息傳遞，從而參與疼痛調(diào)節(jié)[23]，SLC6A4基因多態(tài)性與慢性疼痛綜合征患者疼痛敏感性的個(gè)體差異有關(guān)[24-25]。

綜上所述，中醫(yī)藥在DPN 治療中應(yīng)用廣泛，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)剖析了當(dāng)代醫(yī)家采用中醫(yī)藥治療DPN 的用藥規(guī)律及其核心藥物潛在的作用機(jī)制，為后期中藥抗DPN 機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。