張勝碧 劉燕玲 徐儷穎

1.溫州市中醫(yī)院藥劑科，浙江溫州 325000；2.金華市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，浙江金華 321017；3.浙江省中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江杭州 310000

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是內(nèi)源性或外源性栓子阻塞致肺循環(huán)受阻的一種臨床綜合征，影響APE 患者身心健康[1]。西藥效果好，但有不良反應(yīng)[2]，中西聯(lián)合可提高治療效果，減少不良反應(yīng)[3]。

疏血通注射液由水蛭、地龍制成[4]，用于急性腦梗死患者的治療[5-6]。動(dòng)物研究表明其能抑血栓形成，促血栓溶解[7]。臨床發(fā)現(xiàn)其可有效改善患者微循環(huán)[8]，但機(jī)制不清楚。因此，本研究建立APE 模型，探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 雄性7 周齡SD 大鼠75 只，體重（250±20）g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心飼養(yǎng)，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2018-0012。本研究參照中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒，貨號(hào)：A001-3-2、A044-1-1、A005-1-2，南京建成生物研究所；疏血通注射液，批號(hào)：14040121，中國(guó)牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司；Bcl-2，貨號(hào)：AF6139，Affinity。Bax、Caspase-3、β-actin抗體，貨號(hào)：2772、9662、4967，CST。Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP），貨號(hào)：ab6721，Abcam。

Micro17R 低溫高速離心機(jī)（賽默飛）；AE2000 顯微鏡（Motic 實(shí)業(yè)集團(tuán)）；Tanon-1600 凝膠成像儀（天能集團(tuán)）。

1.3 模型制備

75 只SD 大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1 周，將其按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組，模型組，疏血通低、中、高劑量組，每組各15 只。無(wú)菌條件下眼眶靜脈取血，靜置4 h 凝固，制成血栓栓子（1.1 mm×2.0 mm），加入2 ml 生理鹽水制成血栓混懸液，4℃冷藏備用。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，左頸部剪毛消毒，行縱行切口，分離頸外靜脈，插入導(dǎo)管針至肺動(dòng)脈，注入血栓混懸液約30 個(gè)栓子，縫合切口，當(dāng)大鼠呼吸加快加深時(shí)，即APE 模型建立成功[9]。假手術(shù)組注入等量生理鹽水。造模前2 h，疏血通低、中、高劑量組分別皮下注射0.25、0.5、1 ml/kg 的疏血通注射液；假手術(shù)組和模型組均皮下注射等體積二甲基亞砜（Dimethy sulfoxide，DMSO）[10]。

1.4 平均肺動(dòng)脈壓 （mean pulmonary arterial pressure，mPAP）、右心室壓力（right ventricular pressure，RVP）測(cè)定

所有大鼠血栓4 h 后，戊巴比妥鈉麻醉，分離右側(cè)頸外靜脈，插入聚苯乙烯管0.9 mm 內(nèi)徑測(cè)定并記錄。

1.5 血?dú)夥治?/h3>

所有大鼠處死前頸動(dòng)脈插管，取5 ml 血置抗凝管，采用全自動(dòng)血?dú)夥治鰴C(jī)進(jìn)行血?dú)夥治?，檢測(cè)指標(biāo)包括動(dòng)脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）和動(dòng)脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）的水平。

1.6 肺臟病理檢測(cè)

處死大鼠后分離肺組織，置10%甲醛固定，石蠟包埋，切片。HE 染色，顯微下觀察并記錄組織病理情況。

1.7 肺濕干重比

取右肺組織稱重后，在80°C 恒溫烘箱中干燥24 h，再稱重。兩次重量比作為肺濕干重比的指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)組織水腫。

1.8 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明，采用WST-1 法測(cè)定肺組織SOD、MPO、GSH 活性。

1.9 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取大鼠肺組織切片，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明行TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并于顯微鏡下拍照觀察。

1.10 Western blot 檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3 的蛋白表達(dá)

BCA 法測(cè)定肺組織蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜；將膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中搖床振蕩1.5～2.0 h 后TBST 洗3 次，隨后分別采用兔抗大鼠Bcl-2 抗體（稀釋1∶2000）、Bax 抗體（稀釋1∶2000）、Caspase-3 抗體（稀釋1∶500）于4℃搖床振蕩封閉過(guò)夜，再加入二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（1：2000）孵育2 h，洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，用Image J 軟件分析蛋白條帶。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用One-way-ANOAY 分析，組內(nèi)比較采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mPAP、RVP 水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組mPAP、RVP 水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組比較，疏血通中、高劑量組mPAP 水平降低，疏血通高劑量組RVP 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與疏血通低劑量組比較，疏血通中、高劑量組mPAP 水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，模型組PaO2水平顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組比較，疏血通高劑量組PaO2水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。各組之間PaCO2水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠肺臟病理檢測(cè)結(jié)果比較

假手術(shù)組大鼠肺組織切片中沒(méi)有明顯的病理性損傷；在進(jìn)行血栓栓子處理引發(fā)肺部栓塞后，模型組大鼠肺切片中能觀察到肺泡內(nèi)和間質(zhì)水腫，肺組織損傷嚴(yán)重，而疏血通高、中、低劑量組大鼠肺組織則呈現(xiàn)一定的肺組織損傷改善，其中以高劑量組改善情況更明顯。見(jiàn)圖3。

2.4 各組大鼠肺濕干重比比較

與假手術(shù)組比較，模型組肺濕干重比升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組和疏血通低劑量組比較，疏血通高劑量組肺濕干重比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 各組大鼠肺組織SOD、MPO、GSH 活性水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組SOD、GSH 活性水平降低，MPO 活性水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組比較，疏血通中、高劑量組SOD 活性水平升高、MPO 活性水平降低，疏血通高劑量組GSH活性水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），與疏血通低、中劑量組比較，疏血通高劑量組MPO 活性水平均降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），與疏血通低劑量組比較，疏血通高劑量組GSH 活性水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖5。

2.6 各組大鼠組織細(xì)胞凋亡情況比較

假手術(shù)組幾乎無(wú)細(xì)胞凋亡。模型組出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡；疏血通低劑量組細(xì)胞凋亡情況有所緩解，疏血通中、高劑量組凋亡情況改善明顯。見(jiàn)圖6。

2.7 各組大鼠肺組織蛋白表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組肺組織中Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平升高，Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組比較，疏血通中、高劑量組肺組織中Bax 蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平升高，疏血通高劑量組肺組織Caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與疏血通低劑量組比較，疏血通高劑量組肺組織Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與疏血通中劑量組比較，疏血通高劑量組肺組織Bax 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖7。

3 討論

腎病綜合征患者APE 發(fā)病率可達(dá)59.3%，阻礙氣體交換，加劇血管收縮[11-13]。本研究用自體血栓栓塞并采用改良的經(jīng)頸靜脈栓塞法，減少了排異反應(yīng)，縮短了栓子運(yùn)行距離，確保大鼠栓塞程度的均一性，有助于實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確[14-15]。模型組mPAP、RVP 水平上升，而PaO2降低，提示APE 發(fā)生后機(jī)體會(huì)發(fā)生肺部血流動(dòng)力學(xué)障礙，分析原因可能是機(jī)體損傷后體內(nèi)炎癥因子大量聚集，損傷心肌組織，造成血栓性動(dòng)脈高壓[16]。而疏血通高劑量組mPAP、RVP 水平下降，提示疏血通注射液可有效降低肺動(dòng)脈壓力，可能是其有效成分能減少肺動(dòng)脈平滑肌增殖，抑制肺動(dòng)脈重建[17-18]。疏血通高劑量組的肺濕干重比顯著低于模型組，提示疏血通注射液可以改善肺組織水腫情況，且呈濃度依賴性[19]。

維持機(jī)體自由基的平衡依賴于氧自由基清除酶系統(tǒng)，組織缺血，氧自由基清除能力降低。APE 患者機(jī)體氧化/抗氧化失衡，自由基過(guò)多，加之大量活性氧產(chǎn)物生成，造成肺組織損傷，而當(dāng)疏血通注射液處理后，SOD、GSH 含量升高，提示疏血通注射液可以激活氧自由基清除酶系統(tǒng)活性，發(fā)揮抗炎抗氧化作用，減少超氧陰離子對(duì)肺組織的損傷[20]。

Caspase-3 可剪切PARP，引起細(xì)胞凋亡[21-23]。Bax為與Bcl-2 同源的水溶性蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 蛋白對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜通透性等組成性表達(dá)減弱Bax 介導(dǎo)的Cyt-C 釋放，同時(shí)可抑制Caspase 激活凋亡途徑，Bax 的過(guò)度表達(dá)同樣可拮抗Bcl-2 的保護(hù)效應(yīng)，使細(xì)胞凋亡[24-27]。TUNEL 檢測(cè)顯示疏血通高劑量組細(xì)胞凋亡顯著降低，Bax、Caspase-3 表達(dá)下降，Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平上升，這與馬璐璐等[28]的研究結(jié)果相符，提示疏血通注射液可有效抑制細(xì)胞凋亡，可通過(guò)上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，降低Bax、Caspase-3 表達(dá)，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，疏血通注射液對(duì)APE 大鼠具有一定的保護(hù)作用，且其保護(hù)作用可能是通過(guò)降低Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)，提高Bcl-2 蛋白表達(dá)活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。