撖冬榮，姚拓，李海云，陳敏豪，高亞敏，李昌寧，白潔，蘇明

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

垂穗披堿草（Elymus nutans）屬于禾本科小麥族披堿草屬［1］，其營養(yǎng)價(jià)值與種植面積雖不及“牧草之王”紫花苜蓿（Medicago sativa），但其具有根系發(fā)達(dá)，抗寒抗旱性強(qiáng)，適應(yīng)性廣的特性，是惡劣環(huán)境中的主要牧草和優(yōu)勢種，被廣泛用于生態(tài)修復(fù)［2］。目前，就如何提高垂穗披堿草產(chǎn)量、品質(zhì)以及適應(yīng)性等方面，較多的是從育種、播種方式以及貯存手段等方面進(jìn)行探究，而通過微生物肥料來提高產(chǎn)量、營養(yǎng)品質(zhì)等的研究較少。

化肥（chemical fertilizer，CF）是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)中發(fā)揮著重要作用［3］。農(nóng)作物增產(chǎn)的50%依賴于化肥［4］，而化肥利用率卻不足30%［5］，據(jù)中國統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，從1980-2015年，中國化肥施用量由1300萬t增加到6000萬t［6］，其增加幅度遠(yuǎn)超耕地面積。長期過量施肥不僅造成資源的極大浪費(fèi)，還導(dǎo)致土壤質(zhì)量惡化、生態(tài)環(huán)境破壞、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)降低等一系列問題［7］。因此，從生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展等方面綜合考慮，微生物肥料替代部分化肥是解決上述問題的有效途徑［8］。微生物肥料（microbial fertilizer，MF）作為一種新型環(huán)保型肥料，具有促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收、抑制病原菌、提高肥料利用率、改良土壤質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于禾谷類、油料類等作物，且增產(chǎn)與土壤改良效果明顯［9］。研究發(fā)現(xiàn)，將類芽孢桿菌（Paenibacillus）S6和1-18、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）56接種于小麥（Triticum aestivum）上，其產(chǎn)量分別提高6.9%、8.8%和10.4%［10］；菌肥用量0.9 kg·m-2時(shí)番茄（Solanum lycopersicum）坐果數(shù)和總重最大，分別高于常規(guī)施肥處理的42.86%和36.36%［11］，且絕大部分微生物肥料對作物的增產(chǎn)幅度為10%～20%［12］。但是，微生物肥料的研究與應(yīng)用主要集中于經(jīng)濟(jì)作物，草地畜牧業(yè)中研究較少，而牧草既是草地畜牧業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)也是生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者，與人類生產(chǎn)生活關(guān)系極為密切，同時(shí)，我國不斷推動著種植結(jié)構(gòu)由傳統(tǒng)的二元結(jié)構(gòu)向糧食作物-經(jīng)濟(jì)作物-飼料作物的三元結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，草地畜牧業(yè)在農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值中的比重越來越大［13］。因此，微生物肥料替代部分化肥在畜牧業(yè)中的研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

鑒于此，以垂穗披堿草為研究對象，設(shè)置化肥減量20%和40%分別配施不同劑量微生物肥料，通過分析農(nóng)藝性狀、根系、營養(yǎng)品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)降低化肥施用量，減少環(huán)境污染和石化能源的消耗，篩選出微生物肥料與化肥最佳配比，為垂穗披堿草制定最優(yōu)施肥方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株 普羅威登斯菌（Providencia rettgeri，菌株P(guān)2），克什米爾小陌生菌（Advenella kashmirensis，菌株P(guān)4），醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus，菌株P(guān)19），腐敗沙雷菌（Serratia plymuthica，菌株P(guān)35），由本課題組提供［14］。

1.1.2供試植株 垂穗披堿草（E.nutans），由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.1.3微生物肥料 將菌株P(guān)2、P4、P19、P35分別單接種于無菌LB液體培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)2～3 d（180 r·min-1，28℃），各菌液含菌量達(dá)108cfu·mL-1時(shí)，將菌液按等比例混合，備用。以草炭、木炭和粉碎的玉米秸稈3種載體等比例混合后作為菌肥載體，間隔12 h滅菌（121℃，26 min）兩次，將滅菌完的載體放入超凈工作臺降至室溫后取1 kg裝入聚乙烯袋中，加適量無菌水再加混合菌液80 mL，封口并用無菌針扎小孔，以便透氣［15］，并置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d。

1.1.4化學(xué)肥料 復(fù)合型化肥產(chǎn)自湖北新洋豐肥業(yè)股份有限公司，養(yǎng)分含量≥45%［m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=14∶16∶15］。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年7月在智能生長室進(jìn)行，生長條件模擬室外生長條件，白天：光照16 h，濕度45%，溫度23℃；夜晚：黑暗8 h，濕度45%，溫度19℃。用上述微生物肥料與化肥拌種，將種子（20粒·盆-1）均勻種植于盛有1 kg土壤的花盆（上口徑15 cm、底徑11 cm、高度13.3 cm）中，出苗后間苗（每盆留15株長勢均一的植株），分別于盛花期收獲第1茬和第2茬植株，測定各指標(biāo)。試驗(yàn)共設(shè)11個處理（4次重復(fù)），具體設(shè)置如下：CK：100%CF（300 kg·hm-2CF）；B1：MF（60）+80%CF；B2：MF（90）+80%CF；B3：MF（120）+80%CF；B4：MF（150）+80%CF；B5：MF（180）+80%CF；C1：MF（60）+60%CF；C2：MF（90）+60%CF；C3：MF（120）+60%CF；C4：MF（150）+60%CF；C5：MF（180）+60%CF。

1.3 測定方法

1.3.1農(nóng)藝性狀測定 每個花盆隨機(jī)選取10株進(jìn)行農(nóng)藝性狀測定，采用直尺法［16］測定株高（自然高度），采用游標(biāo)卡尺法［16］測定莖粗（相同位置），采用烘干法［16］測定生物量。

1.3.2根系形態(tài) 采用LA 2400 scanner型根系掃描儀（Epson Expression 1000 XL，中國）測定總根長、總根表面積和總根體積［17］。

1.3.3營養(yǎng)品質(zhì)測定 采用凱氏定氮法［18］測定粗蛋白（crude protein，CP）含量；采用粗脂肪測定儀（SZF-06A，中國河北）測定粗脂肪（ether extract，EE）含量［18］；采用Van Soets法測定酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）和中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量［18］：分別稱取1.0 g烘干研磨的過篩（1 mm）草樣于烘干恒重的聚酯纖維濾網(wǎng)帶中，放入配制好的洗滌液中進(jìn)行測定。

式中：m為試樣質(zhì)量；m1為濾網(wǎng)袋質(zhì)量；m2為ADF或NDF和濾網(wǎng)袋質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析和差異顯著性檢驗(yàn)，采用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物肥料與化肥減量配施對垂穗披堿草農(nóng)藝性狀的影響

化肥減量20%和40%與不同劑量微生物肥料配施，第1茬植株莖粗和干草產(chǎn)量均高于第2茬（表1）。MF（90）+80%CF（B2）配施，第1茬和第2茬株高、莖粗、干草產(chǎn)量均最大，其中，第1茬株高、莖粗、干草產(chǎn)量較CK分別提高34.86%、44.83%、3.08%；第2茬株高、莖粗、干草產(chǎn)量較CK分別提高80.43%、66.34%、13.08%，差異顯著（P＜0.05）。

表1 垂穗披堿草農(nóng)藝性狀特征變化Table 1 Changes in agr onomic characteristics of E.nutans

2.2 微生物肥料與化肥減量配施對垂穗披堿草根系的影響

各處理水平下，植株總根長均高于CK，且差異顯著（P＜0.05），其中，MF（60）+80%CF（B1）和MF（90）+80%CF（B2）處理，植株總根長較CK分別提高34.77%和34.61%（圖1）；B2植株總根表面積較CK提高8.66%；植株總根體積呈先增高后降低再逐漸升高的變化趨勢，MF（120）+80%CF（B3）處理總根體積最大，較CK增加45.54%；地下鮮重與地下干重均呈先升高后降低再緩慢升高的變化趨勢，植株地下鮮重和地下干重較CK分別提高19.39%和51.04%。

圖1 垂穗披堿草根系的變化特征Fig.1 Root morphological characteristics of E.nutans

2.3 微生物肥料與化肥減量配施對垂穗披堿草營養(yǎng)品質(zhì)的影響

80%CF和60%CF與不同劑量微生物肥料配施，第1茬植株各指標(biāo)均優(yōu)于第2茬（圖2）。MF（150）+80%CF（B4）處理，第1茬CP含量最高，較CK增加36.09%。MF（120）+80%CF（B3）處理，第2茬CP含量最高，較CK增加25.30%；第1茬和第2茬EE含量均最高，分別較CK增加22.97%和14.61%；第1茬ADF含量較CK降低6.59%。MF（180）+80%CF（B5）處理，第2茬ADF含量較CK降低8.13%。MF（90）+80%CF（B2）處理，第1茬NDF含量最低，較CK降低15.64%。B5處理第2茬NDF含量最低，較CK降低8.88%。

圖2 垂穗披堿草營養(yǎng)品質(zhì)變化特征Fig.2 Var iation of nutritional quality of E.nutans

2.4 主成分分析

2.4.1垂穗披堿草第1茬指標(biāo)間的相關(guān)性 為比較化肥減量配施微生物肥料對垂穗披堿草生長的影響，將粗蛋白、粗脂肪、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、株高、莖粗和干草產(chǎn)量作為因子分析的變量，采用主成分分析綜合評價(jià)。TS與NDF呈顯著（P＜0.05）負(fù)相關(guān)（表2），ADF與NDF呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)。第1主成分方差貢獻(xiàn)率為40.85%，2個主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為67.65%（表3）。通過主成分分析計(jì)算不同處理的綜合得分（表4）為：B2＞B3＞CK＞B1＞B4＞C4＞B5＞C1＞C2＞C5＞C3，分析結(jié)果表明，MF（90）+80%CF（B2）處理對植株生長最佳。

表2 第1茬各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 2 Correlation coefficient matrix of the indices in the first harvest

表3 第1茬主成分分析的特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 3 The eigenvalue and variance contribution rate of principal component analysis in the first harvest

表4 第1茬中不同處理各主成分綜合得分及排名Table 4 Compr ehensive scores and r ankings of the pr incipal components of differ ent tr eatments in the fir st har vest

2.4.2垂穗披堿草第2茬指標(biāo)間的相關(guān)性 將粗蛋白、粗脂肪、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量和株高、莖粗、干草產(chǎn)量及總根長、總根表面積、總根體積、地下鮮重、地下干重共12個指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。12個指標(biāo)因子相關(guān)系數(shù)矩陣（表5）表明，NDF與ADF、PH與TS、PH與UDW和UFW、TRL與TRS呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），ADF與UDW和UFW呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），UDW與UFW呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。第1主成分方差貢獻(xiàn)率為38.75%，4個主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)76.52%（表6）。通過主成分分析綜合得分評價(jià)，化肥減量配施不同微生物肥料對植株生長增效順序?yàn)椋築2＞B1＞B3＞C3＞B5＞C2＞B4＞C5＞C1＞C4＞CK，表明微生物肥料替代部分化肥可促進(jìn)植株生長，且MF（90）+80%CF（B2）處理對垂穗披堿草生長促進(jìn)效果最好（表7）。

表5 第2茬各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 5 Cor relation coefficient matrix of the indices in the second har vest

表6 第2茬主成分分析的特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 6 The eigenvalue and variance contribution rate of principal component analysis in the second har vest

表7 第2茬中不同處理各主成分綜合得分及排名Table 7 Compr ehensive scor es and r ankings of the pr incipal components of different tr eatments in the second har vest

3 討論

3.1 微生物肥料與化肥減量配施對垂穗披堿草農(nóng)藝性狀的影響

株高、莖粗和生物量是評價(jià)植株生長狀況的重要表觀現(xiàn)象［19］。本研究通過化肥減量配施不同劑量微生 物 肥 料 發(fā) 現(xiàn)，80%CF（240 kg·hm-2）配 施90 kg·hm-2MF可明顯增加株高、莖粗、干草產(chǎn)量，其中，第1茬株高、莖粗和干草產(chǎn)量較CK分別提高34.86%、44.83%和3.08%，第2茬株高、莖粗和干草產(chǎn)量較CK分別提高80.43%、66.34%、13.08%，且第2茬比第1茬提高幅度大，可能原因是受促生菌在根際定殖位置、定殖時(shí)長及作用機(jī)理的影響，因?yàn)椴糠执偕⒉皇侵苯訉χ参锲鹱饔?，而是通過自身產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物起間接性作用或?qū)⑼寥鲤B(yǎng)分轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，植物再通過其他途徑吸收利用養(yǎng)分。劉慶豐等［20］研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌XF-1在白菜（Brassica pekinensis）根部定殖量呈先降低后上升再降低的變化趨勢，當(dāng)促生菌與宿主植物相互適應(yīng)時(shí)此變化才趨于穩(wěn)定，同時(shí)Chen等［21］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌（Bacillus）JM-1128在棉花（Gossypium）上7 d內(nèi)定殖量顯著下降，而7～21 d內(nèi)定殖量下降緩慢。因此，促生菌定殖過程十分復(fù)雜，受根系分泌物、植物生長狀況、細(xì)菌趨化性［22］、細(xì)菌營養(yǎng)型［23］、土壤水分、透氣性及酸堿度等生物和非生物因素影響，這些因素可影響微生物肥料促生效果。

3.2 微生物肥料與化肥減量配施對垂穗披堿草根系的影響

根際是微生物肥料發(fā)揮作用的場所，其中最主要的部分是植物根系，它是養(yǎng)分循環(huán)利用的主要通道，起固定植物的關(guān)鍵作用［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，化肥減量20%和40%配施微生物肥料，垂穗披堿草總根長、總根表面積、總根體積及根系生物量較CK高，80%CF（240 kg·hm-2）配施90 kg·hm-2MF，其總根長、總根表面積較CK提高了34.61%和8.66%；80%CF（240 kg·hm-2）配施120 kg·hm-2MF，其總根體積、根系鮮重和根系干重分別較CK提高了45.54%、19.39%和51.04%。陳香碧等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在干濕交替的稻田土壤中，化肥減量使水稻（Oryza sativa）根長密度、根重密度、根表面積、根活性吸收面積和根系氧化能力比全化肥處理大幅度增加（約40%），有利于水稻良好根系形態(tài)的形成。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨微生物肥料劑量增大，根系各指標(biāo)降低，原因可能是大劑量微生物肥料與化肥配施或施用肥料過量會對植物根系產(chǎn)生毒害作用，因此，施肥量超出適宜范圍不僅未起到促進(jìn)根系生長的作用，甚至?xí)种聘嫡ＩL發(fā)育；另外，促生菌會大量定殖在根系表面且快速繁殖，生長到一定程度形成一層菌膜包裹在根系表面，進(jìn)而影響根系透氣性，抑制根系呼吸作用，同時(shí)一些促生菌生長繁殖過程中會與根系爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，這些原因可能會導(dǎo)致根系生長受限。

3.3 微生物肥料與化肥減量配施對垂穗披堿草營養(yǎng)品質(zhì)的影響

粗蛋白、粗脂肪、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維均是牧草重要的營養(yǎng)指標(biāo)［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，微生物肥料對垂穗披堿草營養(yǎng)物質(zhì)積累具有促進(jìn)作用，在其第1茬生長過程中發(fā)現(xiàn)，化肥減量配施微生物肥料后，植株CP和EE含量隨微生物肥料劑量增加呈先上升后下降的變化趨勢，ADF和NDF含量隨微生物肥料劑量增加呈下降趨勢。Yanni等［27］從水稻根際分離出聯(lián)合固氮細(xì)菌（Rhizobium leguminosarumbv.trifolii）并接種于水稻，發(fā)現(xiàn)顯著增加了水稻CP含量收獲指數(shù)。韓華雯等［28］研究發(fā)現(xiàn)，單施固氮菌肥或施用固氮（或溶磷）菌肥+半量化肥，能使燕麥（Avena sativa）各生育期CP和EE含量顯著提高，菌肥+半量化肥使燕麥NDF和ADF含量降低。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，80%CF配施90和120 kg·hm-2MF后，牧草生育期可提前7 d左右，根據(jù)李菲菲等［29］研究發(fā)現(xiàn)，牧草營養(yǎng)品質(zhì)隨生育期呈先上升后降低趨勢，本研究結(jié)果與其一致，因此，微生物肥料可縮短垂穗披堿草生育期這一發(fā)現(xiàn)對解決高寒地區(qū)因氣候條件而不能滿足作物正常生長發(fā)育這一問題有較為重要的研究價(jià)值和實(shí)際意義，后續(xù)需進(jìn)行深入研究。研究還發(fā)現(xiàn)垂穗披堿草第2茬營養(yǎng)品質(zhì)顯著低于第1茬，原因可能是本試驗(yàn)采用盆栽方式進(jìn)行，可供牧草生長的空間和所含養(yǎng)分有限，牧草生長到第2茬時(shí)養(yǎng)分缺失。

4 結(jié)論

1）化肥減量配施微生物肥料對垂穗披堿草的生長促進(jìn)效果顯著，且第1茬促生效果優(yōu)于第2茬。2）通過主成分分析綜合評價(jià)結(jié)果表明，80%化肥（240 kg·hm-2）配施微生物肥料（90 kg·hm-2）對促進(jìn)垂穗披堿草生長和營養(yǎng)品質(zhì)的積累效果最顯著，是最佳肥料量配比。