張曉敏，孟根花，藺婷娟，陳秀梅，陳喜榮

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

為了能夠快速提高果蔬、糧食產(chǎn)量，大量農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用甚至濫用[1-2]，一些農(nóng)藥可以長(zhǎng)期存在于土壤和環(huán)境中，并在人體和動(dòng)植物體內(nèi)不斷累積，威脅人類健康，農(nóng)藥殘留問題近年來引起各界對(duì)食品安全的關(guān)注[3-5]。牛乳中含有多種人體所需的氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，是老幼皆宜的營(yíng)養(yǎng)食品[6-8]。牛乳中的農(nóng)藥殘留主要與動(dòng)物飼料使用的農(nóng)藥有關(guān)，如稻米、玉米、高粱、麥類和豆類等，施用品種多樣，且產(chǎn)業(yè)鏈較長(zhǎng)，會(huì)在運(yùn)輸過程中受到各種污染，影響到牛乳的安全性[9]，在牛乳生產(chǎn)過程中建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行監(jiān)控是較為緊迫的問題。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法主要有色譜法和色譜-質(zhì)譜法[10]，有文獻(xiàn)也報(bào)道了多壁碳納米管-聚醚砜復(fù)合膜凈化法，快速測(cè)定食品中農(nóng)藥殘留效果較好[11]，脂質(zhì)去除分散固相萃取法-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中農(nóng)藥殘留，結(jié)果優(yōu)異[12]。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有專一性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，是較好的檢測(cè)方法[13-15]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于基質(zhì)復(fù)雜、干擾嚴(yán)重的痕量化合物的分析，且有靈敏、快速和定性準(zhǔn)確等特點(diǎn)[16]。由于牛乳中含有脂肪、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和糖類等干擾成分，對(duì)樣品前處理要求必須除去干擾成分來避免對(duì)儀器的污染[10]。QuEChERS技術(shù)是近年新興的一種不用濃縮、快速檢測(cè)多種農(nóng)藥殘留的前處理方法[17-18]，利用鹽包除去水分及鹽析，凈化包除去糖類、脂肪酸、脂類、有機(jī)酸及色素等干擾物，可減小基質(zhì)效應(yīng)[10]。該技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)單與節(jié)省試劑等優(yōu)點(diǎn)，已有研究在牛乳、豆乳及乳制品中得到廣泛應(yīng)用[19-22]，解決了傳統(tǒng)方法中費(fèi)時(shí)和浪費(fèi)試劑等問題[23]。

本研究應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立一種同時(shí)檢測(cè)牛乳中6 種農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品 市售。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98.0%）：噻蟲胺 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；吡蟲啉、滅多威、殺線威、嘧菌酯、多菌靈 北京壇墨公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)Meker公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Fisher公司。

鹽包：MgSO4（4.0 g）、NaCl（1.0 g）、TSCD4（1.0 g）、DHS（0.5 g）和凈化包：150 mg乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propyl silane，PSA）/900 mg MgSO4中國(guó)迪科馬公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3k30高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；LC-30AD超高效液相色譜儀 日本島津公司；SCIEX Qtrap 5500三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；Multi Reax全能型振蕩器 德國(guó)Heidolph公司；KQ-300DE超聲波清洗儀 黑龍江立高設(shè)備公司；TurboVaP LV氮吹濃縮儀 瑞典Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）：分別吸取一定量各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用乙腈定容，于0～4 ℃避光保存。

6 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）：分別移取0.1 mL各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，于0～4 ℃避光保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取10 g牛乳（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈于振蕩器渦旋10 min進(jìn)行提取，加入QuECHERS鹽包，立即上下顛倒或渦旋搖晃，避免結(jié)塊，繼續(xù)渦旋10 min，在室溫下4 000 r/min離心5 min，取上清液7 mL轉(zhuǎn)移至15 mL含PSA凈化劑的離心管中，振搖混勻，再次渦旋5 min，在室溫下4 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液4 mL，40 ℃氮吹至干。用1 mL體積分?jǐn)?shù)5%甲酸-乙腈水溶液復(fù)溶，樣液經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后上機(jī)分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

選擇空白樣品，不加入任何標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)過樣品前處理，得到定容液。稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，將6 種農(nóng)藥配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、40.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣上機(jī)測(cè)定，橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度（x），縱坐標(biāo)為響應(yīng)值（y），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：安捷倫色譜柱Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B：乙腈；流速0.45 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積3 μL；梯度洗脫程序：0～3.0 min，95%～70%流動(dòng)相A；3.0～9.0 min，60%流動(dòng)相A；9.0～16.0 min，1%流動(dòng)相A；16.0～18.0 min，95%流動(dòng)相A。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離（elaectrospray ionization，ESI）源正離子模式（ESI+），離子化電壓4 500 V，離子源溫度550 ℃，氣簾氣壓力40 psi（275.8 kPa），噴霧氣壓力（GAS1）55 psi（379.225 kPa），輔助加熱氣壓力（GAS2）55 psi（379.225 kPa）。掃描模式：采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集數(shù)據(jù)，具體參數(shù)如表1所示。

表 1 6 種農(nóng)藥的質(zhì)譜測(cè)定條件Table 1 Mass spectrometric conditions for analysis of six pesticides

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算

通過空白基質(zhì)配制1 μg/L和10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，峰面積記為A1，用復(fù)溶液配制相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰面積記為A2，基質(zhì)效應(yīng)按下式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SCIEX Qtrap 5500 MultiQuant數(shù)據(jù)定量處理軟件分析數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)出后用Office Excel 2007進(jìn)行表格繪制和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取劑的選擇

分別選擇1%乙酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、乙腈作為提取溶劑，比較6 種農(nóng)藥殘留的提取效果。相關(guān)報(bào)道認(rèn)為，乙腈能溶解多種無機(jī)、有機(jī)物質(zhì)，且在液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中是干擾最小的一種溶劑[24]，本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論，從干擾雜峰來看，加入一定量的乙酸和甲酸對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并沒有太大的改善，乙腈作為提取溶劑時(shí)雜峰和干擾峰最少，且提取的回收率也最佳，6 種農(nóng)藥的回收率為85.1%～96.1%，如圖1所示，因此采用單一乙腈溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取。

2.2 樣品凈化方法的選擇

牛乳經(jīng)過萃取后存在如脂肪酸、酚類和碳水化合物等雜質(zhì)，需要采用一定手段和技術(shù)對(duì)其進(jìn)行凈化處理后，才能有效檢測(cè)農(nóng)藥殘留。本研究比對(duì)市面上多種凈化包的特性和成分，針對(duì)牛乳中含有的糖類和脂肪酸，選擇合適的吸附劑去除干擾物質(zhì)，且不影響回收率，經(jīng)過篩選，選擇石墨化炭黑、C18和PSA作為固相萃取材料進(jìn)行處理。結(jié)果表明，含有PSA成分的凈化包凈化效果最理想，回收率最佳。石墨化炭黑主要是針對(duì)有色物質(zhì)的去除效果較好，而C18的凈化效果、峰形和基線沒有采用PSA的凈化效果理想，并且由于PSA含有叔胺基團(tuán)，有比氨基柱更強(qiáng)的離子交換能力，可有效去除有機(jī)酸、色素和金屬離子。所以，確定采用含有PSA成分的凈化包進(jìn)行處理。

2.3 復(fù)溶液的選擇

參考GB/T 23211—2008《牛奶和奶粉中493 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[25]，根據(jù)流動(dòng)相選擇60%乙腈、20%甲醇、20%乙腈、5%甲酸-乙腈溶液為復(fù)溶液，對(duì)比這幾種復(fù)溶液對(duì)色譜峰的峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，5%甲酸-乙腈溶液作為復(fù)溶液，6 種農(nóng)藥殘留峰形及響應(yīng)值均優(yōu)于其他3 種復(fù)溶液，可能是由于該復(fù)溶液更接近于流動(dòng)相的比例。

2.4 色譜柱的選擇

根據(jù)GB/T 23211—2008[25]，本研究考察安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱和Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）對(duì)6 種農(nóng)藥殘留的分離效果。結(jié)果表明，Poroshell 120 EC-C18色譜柱能實(shí)現(xiàn)6 種農(nóng)藥殘留的同時(shí)有效分離，色譜峰形好，靈敏度高，因此選擇Poroshell 120 EC-C18色譜柱作為分離柱，并優(yōu)化了進(jìn)樣量、流動(dòng)相梯度條件。

2.5 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)GB/T 23211—2008[25]和參考文獻(xiàn)[26]，首選0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相，同時(shí)比較甲醇、乙腈、乙腈-甲酸、甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨溶液為流動(dòng)相對(duì)峰形的影響。結(jié)果表明，由于6 種物質(zhì)均為正離子模式下檢測(cè)，單純使用甲醇溶液及乙腈溶液作為流動(dòng)相，殺線威、嘧菌酯出現(xiàn)峰前延現(xiàn)象，噻蟲胺和吡蟲啉色譜峰變寬，滅多威出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象，當(dāng)水相中加入一定量的甲酸后，峰形尖銳、對(duì)稱；而使用甲醇-乙酸銨和乙腈-乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，噻蟲啉、滅多威和殺線威的峰形較差，均有前延現(xiàn)象。綜合考慮分離效果、峰形及準(zhǔn)確度等因素，最終選擇0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動(dòng)相，并采用確定好的色譜條件，可以使6 種農(nóng)藥殘留達(dá)到較好的分離效果。添加質(zhì)量濃度為5 ng/mL時(shí)6 種目標(biāo)化合物的總離子流色譜圖如圖2所示。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

基質(zhì)效應(yīng)大于100%有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，小于100%有基質(zhì)抑制作用，不利于其電離[27]。分別做6 次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果取平均值。由表2可知，6 種農(nóng)藥均有不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此使用空白基質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量來補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)引起的響應(yīng)變化。

表 2 樣品的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of samples %

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

由表3可知，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.995。牛乳中多菌靈、殺線威、滅多威、噻蟲胺、吡蟲啉和嘧菌酯的檢出限均為0.1 μg/kg，其信噪比（RS/N）均滿足≥3的要求，定量限均為1.0 μg/kg，其RS/N均滿足≥10的要求，可以滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[28]要求。

表 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限Table 3 Analytical figures of merit of the proposed method

2.8 加標(biāo)回收率和精密度

選取市售牛乳樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，參考夏衛(wèi)東等[26]研究，分別選3 個(gè)添加水平，加標(biāo)量分別為1.0、2.5、5.0 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)量分別做6 次平行實(shí)驗(yàn)，用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。由表4可知，6 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為76.5%～113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6.1%，說明該方法具有良好準(zhǔn)確度和精密度，符合方法學(xué)要求。

表 4 牛乳中6 種農(nóng)藥殘留的加標(biāo)回收率和精密度測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 4 Recoveries and precision RSDs of six pesticides spiked into blank milk sample (n = 6)

3 結(jié) 論

本研究利用QuEChERS技術(shù)，建立了一種牛乳中6 種農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，對(duì)前處理、凈化方式及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，采用乙腈作為提取劑，鹽包吸水，凈化包除雜，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈為最佳流動(dòng)相，與GB/T 23211—2008方法相比，前處理步驟簡(jiǎn)單，檢出限（0.1 μg/kg）均低于國(guó)標(biāo)方法；標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.995，6 種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為76.5%～113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～6.1%。該方法有效節(jié)約了成本和時(shí)間，能一針進(jìn)樣，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確同時(shí)檢測(cè)6 種農(nóng)藥殘留含量，提高了檢測(cè)效率，特別有利于乳品企業(yè)內(nèi)部實(shí)現(xiàn)大批量檢驗(yàn)與應(yīng)用，為食品安全提供了服務(wù)和保障。