蘭 麗，張彩霞，高萬(wàn)東，余志寶，徐 紅，唐振鑫，范 敏，楊明陽(yáng)，田加美，張雪嬌，張 晶，賀曉鳴，郭素芳

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

牛乳蛋白質(zhì)是人體優(yōu)質(zhì)的食物蛋白來(lái)源，乳蛋白的深入研究是行業(yè)良性發(fā)展的必然需求。牛乳的主要蛋白成分為酪蛋白與乳清蛋白，其中，酪蛋白包括α-、β-、κ-酪蛋白，乳清蛋白包括α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）等[1-3]，有些蛋白成分含量與產(chǎn)品組織狀態(tài)密切相關(guān)，而傳統(tǒng)的凱氏定氮法只能通過(guò)總氮含量間接測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，已無(wú)法滿足特性蛋白的檢測(cè)需求。因此，建立合理、穩(wěn)定的乳蛋白評(píng)價(jià)方法對(duì)乳質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。

目前有關(guān)乳制品中蛋白質(zhì)分析的方法有毛細(xì)管電泳法[4-5]、免疫學(xué)方法[6-7]、平板凝膠電泳法[8-9]、液相色譜法[10]、核磁共振磷譜法[11]、液相色譜-質(zhì)譜法等[12-15]，就目前檢測(cè)A2β-酪蛋白的液相色譜-質(zhì)譜法而言，其主要基于酶解后的肽段含量來(lái)測(cè)定蛋白，不能直接反應(yīng)蛋白含量的變化。基于檢測(cè)成本及設(shè)備考量，建立一種能一次性進(jìn)樣并滿足超高溫（ultra high temperature，UHT）滅菌乳中α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的液相色譜檢測(cè)法，監(jiān)測(cè)UHT乳中蛋白含量，旨在為后續(xù)工藝改善、生產(chǎn)過(guò)程控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售強(qiáng)化A2β-酪蛋白系列牛乳；市售普通UHT滅菌乳。

β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）、κ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥70.0%）、α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥70.0%）、β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥90.0%） 美國(guó)Sigma公司；α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥85.0%）、三氟乙酸（質(zhì)譜級(jí)） 德國(guó)CNW公司；雙[三(羥甲基)氨基甲烷]（BisTris） 上海源葉生物科技有限公司；鹽酸胍上海泰坦化學(xué)有限公司；檸檬酸鈉 天津福晨化學(xué)試劑有限公司；二硫蘇糖醇 河北百靈威超精細(xì)材料有限公司；乙腈（色譜純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260液相色譜儀（配備紫外檢測(cè)器） 美國(guó)安捷倫有限公司；Biofuge Stratos低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；KS501渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司；MILLI-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；分析天平（十萬(wàn)分之一）瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

溶液Ⅰ：稱取2.092 4 g BisTris、57.318 g鹽酸胍、0.157 g檸檬酸鈉、0.300 79 g二硫蘇糖醇，置于容量瓶中，加水定容至100 mL（含0.1 mol/L BisTris、6 mol/L鹽酸胍、5.37 mmol/L檸檬酸鈉、19.5 mmol/L二硫蘇糖醇），現(xiàn)用現(xiàn)配。

溶液Ⅱ：稱取42.988 5 g鹽酸胍，加入100 μL三氟乙酸，用水定容至100 mL（含體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸、4.5 mol/L鹽酸胍），現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

β-酪蛋白工作液配制：用天平（十萬(wàn)分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gβ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。κ-酪蛋白工作液配制：用天平（十萬(wàn)分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gκ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。α-酪蛋白工作液配制：用天平（十萬(wàn)分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gα-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。α-乳白蛋白工作液配制：用天平（十萬(wàn)分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gα-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。β-乳球蛋白工作液配制：用天平（十萬(wàn)分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gβ-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。

1.3.3 樣品測(cè)定

1.3.3.1 試樣制備與處理

吸取400 μL牛乳，加入400 μL溶液Ⅰ，渦旋混勻，室溫靜置1 h，將混合溶液12 000 r/min、4 ℃離心10 min，用槍頭將表層乳脂移開(kāi)，吸取底層溶液300 μL于新的離心管中，加入900 μL溶液Ⅱ，渦旋混勻，用0.45 μm水相濾膜過(guò)濾待測(cè)[16-18]。

生活是很復(fù)雜的，又是很簡(jiǎn)單的。復(fù)雜的是，你總感覺(jué)一天到晚有那么多忙不完的事情；簡(jiǎn)單的是，你可以在某一時(shí)刻只專注于某一件事。時(shí)間是有限的，精力是有限的，如果懶懶散散、渾渾噩噩，一天天過(guò)去，什么進(jìn)步和變化也沒(méi)有。但是，如果每做一件事，都全身心地投入，耐心加恒心，就會(huì)創(chuàng)造出讓人驚訝的成績(jī)。“專注”和“耐心”是我認(rèn)為必須要教會(huì)孩子的事情之一。正好有網(wǎng)友媽媽問(wèn)到我，孩子的注意力不集中怎么辦？應(yīng)該如何培養(yǎng)孩子的專注力？所以，我今天專門(mén)寫(xiě)一篇，總結(jié)一下我的觀點(diǎn)，以及我在日常生活中幫助笑笑學(xué)會(huì)專心的場(chǎng)景和方法。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液處理

將制備好的標(biāo)準(zhǔn)工作液中加入400 μL溶液Ⅰ，渦旋混勻，室溫靜置1 h，將混合溶液12 000 r/min、4 ℃離心10 min，吸取溶液300 μL于新的離心管中，加入900 μL溶液Ⅱ，渦旋混勻，用0.45 μm水相濾膜過(guò)濾待測(cè)。

1.3.3.3 液相色譜條件

色譜柱：菲羅門(mén)-Venus C18（300 ?，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸-乙腈溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸，梯度洗脫；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；梯度洗脫程序如表1所示[16,19]。

表 1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

試樣中蛋白含量按下式計(jì)算。

待測(cè)試樣蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定方法：測(cè)定5 個(gè)系列質(zhì)量濃度的各蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各蛋白線性方程及相關(guān)系數(shù)，將樣品峰面積代入曲線，得到相應(yīng)質(zhì)量濃度。

對(duì)于含有不同亞型的蛋白（如κ-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白），采取峰面積占比形式計(jì)算各亞型含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Agilent ChemStation儀器數(shù)據(jù)分析軟件和Excel軟件對(duì)圖譜和數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的確定

為了選擇合適的前處理方法，本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外目前乳制品中蛋白的液相色譜法測(cè)定進(jìn)行分析，一般包括2 種方法，一是基于等電點(diǎn)沉淀提取酪蛋白，洗滌沉淀進(jìn)行檢測(cè)。劉夢(mèng)云等[10]運(yùn)用此方法進(jìn)行乳粉中酪蛋白的定量檢測(cè)。二是基于用尿素、鹽酸胍、二硫蘇糖醇、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等試劑破壞酪蛋白膠束，打開(kāi)蛋白二硫鍵等方式，使蛋白變性，檢測(cè)蛋白含量。王浩等[20]運(yùn)用此種方法對(duì)乳制品進(jìn)行定量分析，分離出7 種主要蛋白成分（包括酪蛋白）。豆劍偉等[21]運(yùn)用此方法對(duì)3 種酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離。Bonfatti等[22]運(yùn)用此方法對(duì)水牛乳蛋白組分和遺傳變異體進(jìn)行分離和定量。

基于等電點(diǎn)沉淀提取酪蛋白的方式較為復(fù)雜，且不能同時(shí)檢測(cè)乳清蛋白。經(jīng)過(guò)研究，結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作，選擇鹽酸胍和二硫蘇糖醇等搭配無(wú)機(jī)鹽配制緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以充分溶解蛋白質(zhì)，展開(kāi)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，且操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短。

2.2 各蛋白標(biāo)品譜圖

通過(guò)單標(biāo)及曲線線性確定蛋白保留時(shí)間。由圖1～5可知，各蛋白具有較好的分離度，β-酪蛋白包含3 個(gè)變異體，依據(jù)出峰次序依次為B型、A1型、A2型β-酪蛋白，κ-酪蛋白包含3 個(gè)變異體，依據(jù)出峰次序依次為κ1型、κ2型、κ3型κ-酪蛋白，β-乳球蛋白包含2 個(gè)變異體，依據(jù)出峰次序依次為B型、A型β-乳球蛋白。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

參照GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄F“檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求”，對(duì)于確證方法，相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。由表2可知，各蛋白線性方程相關(guān)系數(shù)（r）為0.995以上，能滿足檢測(cè)要求?；跐M足信噪比（RS/N）≥3的要求，得出檢出限。

表 2 各蛋白亞型的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程及檢出限Table 2 Calibration curve equations and detection limits for milk proteins

需要特別強(qiáng)調(diào)的是，β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、κ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品純度無(wú)法達(dá)到100%，例如，β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的色譜帶會(huì)含有少量κ-酪蛋白，故實(shí)驗(yàn)時(shí)，β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白曲線繪制時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液需要單獨(dú)配制，不能配制混標(biāo)。

2.4 樣品檢測(cè)譜圖

分別對(duì)市售普通UHT乳及A2β-酪蛋白牛乳運(yùn)用上述方法進(jìn)行檢測(cè)。由圖6～7可知，在保留時(shí)間30.0 min處為β-酪蛋白，普通UHT乳β-酪蛋白處有3 個(gè)峰，分別為B型、A1型、A2型，A2β-酪蛋白牛乳保留時(shí)間31.5 min處只有A2型β-酪蛋白，該方法可以對(duì)此類滅菌乳鑒定提供檢測(cè)手段。

2.5 各蛋白加標(biāo)回收率（準(zhǔn)確度）

在待測(cè)樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，混合均勻后，按照相同的檢驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，比較加入標(biāo)準(zhǔn)樣品后的含量和理論加標(biāo)量，計(jì)算加標(biāo)回收率。

參照GB/T 27404—2008附錄F“檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求”，樣品中被測(cè)組分含量大于100 mg/kg時(shí)，回收率為95%～105%，本研究測(cè)定的各蛋白含量均大于100 mg/kg。由表3可知，樣品6 次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的回收率為95.2%～105.0%，能滿足檢測(cè)要求。

表 3 市售UHT乳各蛋白的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of milk proteins spiked into commercially available UHT milk

2.6 方法精密度

重復(fù)性是指在重復(fù)性條件下所測(cè)得的相互獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的符合程度。重復(fù)性條件是指在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，由同一操作者使用新建色譜定量分析方法，在較短時(shí)間間隔內(nèi)使用同一儀器對(duì)相同樣品進(jìn)行分析測(cè)定。

參照GB/T 27404—2008附錄F“檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求”，樣品中被測(cè)組分含量≤1%，變異系數(shù)≤2.7%。本研究測(cè)定的蛋白含量＜1%，由表4可知，6 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%～2.70%，能滿足檢測(cè)要求。

表 4 各蛋白平行測(cè)定結(jié)果及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Results and relative standard deviations of determination of milk proteins (n = 6)

2.7 樣品測(cè)定及不同方法間測(cè)定結(jié)果比較

運(yùn)用本研究的液相色譜法對(duì)市售A2β-酪蛋白牛乳樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示；同時(shí)，運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜法[12-13]對(duì)市售3 批次A2β-酪蛋白牛乳中的A2型β-酪蛋白進(jìn)行貨架期跟蹤監(jiān)測(cè)，以進(jìn)行結(jié)果比較，結(jié)果如表6所示。

表 5 某市售A2β-酪蛋白牛乳不同放置時(shí)間各蛋白含量測(cè)定結(jié)果（液相色譜法）Table 5 Contents of κ-casein, β-casein, α-lactalbumin and β-lactoglobulin in commercial A2 β-casein-fortified milk stored for different periods determined by the LC method g/100 mL

表 6 市售3 批A2β-酪蛋白牛乳中A2型β-酪蛋白含量檢測(cè)結(jié)果（高效液相色譜-質(zhì)譜法）Table 6 Contents of A2 β-casein-fortified in three lots of commercial A2 β-casein-fortified milk determined by HPLC-MS g/100 mL

目前，檢測(cè)牛乳蛋白分型無(wú)國(guó)標(biāo)方法，檢測(cè)A2β-酪蛋白也沒(méi)有國(guó)標(biāo)及行標(biāo)方法，公認(rèn)較為準(zhǔn)確的方法為液相色譜-質(zhì)譜法，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的引入使得蛋白質(zhì)分析得到重大改進(jìn)[23-24]。由表5～6可知，放置60 d樣品，液相色譜法檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果接近，液相色譜法檢測(cè)結(jié)果隨放置時(shí)間延長(zhǎng)有輕微降低現(xiàn)象，高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果無(wú)此變化趨勢(shì)，這可能是由于乳蛋白發(fā)生糖基化[25-26]，液相色譜法無(wú)法檢測(cè)糖基化蛋白或由于乳中固有酶類[27-28]導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得液相色譜法無(wú)法檢出，原因還需進(jìn)一步研究分析。在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中，液相色譜法可以進(jìn)行蛋白分型檢測(cè)，此方法可以實(shí)現(xiàn)UHT乳中的α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的一次性檢測(cè)并定量，操作方法簡(jiǎn)單，試劑廉價(jià)易得，設(shè)備易于推廣，但只適用于UHT乳較短貯藏期內(nèi)的蛋白含量監(jiān)測(cè)，且單次分析時(shí)間較長(zhǎng)，高效液相色譜-質(zhì)譜法通過(guò)特異性肽段建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)蛋白進(jìn)行定量，方法較為精準(zhǔn)，但每種蛋白的特異性肽段不同，依據(jù)蛋白特性檢測(cè)的前處理可能不同，實(shí)現(xiàn)幾種蛋白的共同檢測(cè)需要進(jìn)一步研究，且肽段需要人工合成，肽段純度定量較為困難，試劑成本昂貴，對(duì)操作人員要求較高，且設(shè)備不易推廣。

3 結(jié) 論

明確乳制品中蛋白質(zhì)的組分和含量是評(píng)價(jià)乳制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、致敏特性等的基礎(chǔ)，本研究提供了一種液相色譜方法檢測(cè)UHT乳中的蛋白含量，方法簡(jiǎn)便，易于推廣，為企業(yè)工藝改善研究、新產(chǎn)品研究或監(jiān)測(cè)產(chǎn)品中蛋白含量提供了一種檢測(cè)手段。