吳煜，鄧嬌，張曉娜，黃凱豐，陳慶富

貴州師范大學 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心/蕎麥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550001

蕎麥(Buckwheat)屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)，是一種糧藥兼用的雜糧作物[1]．近年來，隨著對蕎麥關(guān)注度的升高、國家扶持力度的增大，蕎麥的種植面積逐年擴大，病蟲害的問題也逐漸增加．2016年首次在貴州省貴陽市烏當區(qū)百宜鎮(zhèn)蕎麥上發(fā)現(xiàn)黑唇平背葉蜂，而后隨著種植面積擴大，發(fā)現(xiàn)其在貴州省蕎麥主產(chǎn)區(qū)上均有分布[2]．

黑唇平背葉蜂Allantusluctifer(F.Smith)，又稱黑翅葉蜂或黑唇十脈葉蜂，屬于膜翅目(Hymenoptera)葉蜂科(Tenthredinidae)葉蜂屬(Tenthredo)，主要危害蓼科蓼屬植物[3]，幼蟲最喜食蕎麥和棉毛葉蓼[4]．其幼蟲以咀嚼式口器取食植物葉片，造成植物缺刻，嚴重時取食整個植物的莖和花，造成光合速率降低，植物減產(chǎn)．目前關(guān)于黑唇平背葉蜂的生物學研究較少，且貴州省作為蕎麥的主要生產(chǎn)大省，對其研究也基本為零．

為了保護生態(tài)系統(tǒng)，生物防治已經(jīng)成為一種有效的替代化學防治的新農(nóng)業(yè)害蟲防治措施，生物防治主要分為天敵防治[5-6]和微生物制劑防治[7]．利用昆蟲病原真菌(Entomopathogenic fungi，EPF)調(diào)節(jié)自然害蟲種群，已成為以生物防治為主導的綜合治理重要途徑之一[8]．蟲草屬(Cordyceps)屬于子囊菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)蟲草科(Cordycipitaceae)[9]，是重要的昆蟲病原真菌屬之一，該屬在我國目前共報道約120種，在自然界中可以持續(xù)存在控制靶標害蟲[10]，在生物防治中發(fā)揮著重要的作用[11-12]．其中，環(huán)鏈蟲草(Cordycepscateniannulata)，又稱環(huán)鏈擬青霉(Paecilomycescateniannulatu)或環(huán)鏈棒束孢(Isariacateniannulata)； 玫煙色蟲草(Cordycepsfumosorosea)，又稱為玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea)； 粉棒束孢(Isariafarinosa)，又稱為粉擬青霉(Paecilomycesfarinosus)，是重要的昆蟲病原真菌，在自然界中廣泛分布，可以寄生感染多種害蟲．目前研究發(fā)現(xiàn)環(huán)鏈蟲草對鱗翅目[13-14]、蜱螨目[15-16]、半翅目[17]等，玫煙色蟲草對鞘翅目[18]、鱗翅目[19]、半翅目[20-22]、雙翅目[23]等，粉棒束孢對害蟲、線蟲和蜱螨類[24]等都有一定的防治效果，但對于蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)，目前對其防治農(nóng)業(yè)害蟲的研究報道較少．因此，測定蟲生真菌對黑唇平背葉蜂幼蟲的致病力，可為減少對環(huán)境有害的化學農(nóng)藥的使用、探究蟲生真菌作為黑唇平背葉蜂生物防治劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)．

因此，本文擬對黑唇平背葉蜂幼蟲的形態(tài)特征、發(fā)育歷期、生長規(guī)律、取食危害情況及蟲生真菌致病力進行實驗，以期為該害蟲的預(yù)防、預(yù)測、預(yù)報及生物防治制劑研發(fā)奠定理論和實踐基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：黑唇平背葉蜂采自貴州省貴陽市烏當區(qū)百宜鎮(zhèn)田間(海拔1 345 m，106°53′E，26°52′N)，帶回實驗室，用小毫筆挑置培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，每皿中鋪兩層圓形濾紙(直徑9 cm)并用無菌水完全濕潤，每天放入大小約為5 cm×6 cm的新鮮多年生苦蕎葉片，用保鮮膜封好并戳孔10個，放置于人工氣候箱(溫度25±1 ℃，相對濕度80%±5%，光照周期L∶D=16∶8)中培養(yǎng)．

供試菌株：如表1，其中4號菌株由貴州大學真菌資源研究所惠贈．

表1 供試蟲生真菌菌株

1.2 方法

1.2.1 黑唇平背葉蜂幼蟲形態(tài)特征、發(fā)育歷期及生長情況的觀察

將黑唇平背葉蜂卵置于培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，每組30個，設(shè)置3個重復．將培養(yǎng)皿放置于1.1條件下連續(xù)培養(yǎng)25 d，每天觀察其幼蟲形態(tài)顏色變化、記錄其蛻皮的時間，在體視顯微鏡下，每日下午2點觀察測定幼蟲體長、體寬(胸部第一節(jié)處)等．

1.2.2 黑唇平背葉蜂幼蟲危害特征觀察

選取1.2.1中相同齡期的幼蟲置于塑料養(yǎng)蟲盒(長、寬、高為19 cm×14 cm×11.5 cm)中，每個蟲齡選10頭，3個重復，每盒中鋪兩層濾紙并用無菌水完全濕潤，放入兩片大小約為6 cm×7 cm的新鮮多年生苦蕎葉片．將培養(yǎng)皿放置于人工氣候箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天觀察不同齡期幼蟲危害葉片的特征并記錄．

1.2.3 黑唇平背葉蜂幼蟲人工飼養(yǎng)取食情況觀察

將1.2.1中不同齡期的黑唇平背葉蜂幼蟲置于培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，每皿中鋪兩層圓形濾紙并用無菌水完全濕潤，每天放入大小約為5 cm×6 cm的新鮮多年生苦蕎葉片，每組30頭，設(shè)置3個重復．將培養(yǎng)皿放置于人工氣候箱中連續(xù)培養(yǎng)25 d．記錄每次新加入新鮮葉片和取食過葉片的質(zhì)量．

1.2.4 黑唇平背葉蜂幼蟲室外取食情況觀察

貴州師范大學蕎麥研究中心植物生長室(海拔1 090 m，106°43′10″E，26°35′31″N)飼養(yǎng)觀察其危害蕎麥的特征．

1.2.5 孢子懸液的制備

將供試菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在150 r/min，25 ℃ 的條件下?lián)u床培養(yǎng)6 d，利用雙層擦鏡紙過濾菌絲，得到孢子懸液．用血球計數(shù)板測定孢子濃度，將孢子懸液用無菌水稀釋成濃度為1×108個/mL．

1.2.6 蟲生真菌致病力測定

采用浸漬法，將3齡的黑唇平背葉蜂幼蟲浸入菌株的孢子懸液5 s，后取出置于培養(yǎng)皿中單頭飼養(yǎng)，用保鮮膜封好并戳孔10個．20頭為1組，3個重復，對照組采用無菌水浸漬，其他條件與實驗組一致．每隔24 h觀察并記錄幼蟲死亡情況，連續(xù)觀察10 d，計算死亡率(M)和校正死亡率(CM)．

M=D/T×100%

CM=(M-C)/(1-C)×100%

式中，D為處理死亡幼蟲數(shù)，T為處理總蟲數(shù)，C為對照死亡率．

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007，SPSS 19對黑唇平背葉蜂幼蟲齡期、體長、體寬、取食情況、致病力進行分析，采用Tukey法在0.05水平對多組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 黑唇平背葉蜂幼蟲的形態(tài)特征

1齡幼蟲，頭部呈黑色且有光澤； 體表呈淡黃色，進食后呈淡綠色； 頭部較胸部大，胸足3對，胸足較發(fā)達，無色透明呈圓錐狀； 腹足不明顯，體側(cè)無氣門出現(xiàn)(圖1a)．

2齡幼蟲，頭部呈褐色且有光澤； 體表呈黃綠色，胸足3對，位于第1至第3腹節(jié)； 腹足7對，位于第4至第10腹節(jié)； 臀足1對，位于第11腹節(jié)； 體側(cè)無氣門出現(xiàn)(圖1b)．

3齡幼蟲，頭部呈褐色且有光澤； 胸足3對，腹足7對，臀足1對，共11對； 體側(cè)出現(xiàn)呈黑色的氣門．體表呈黃綠色，臀板呈嫩黃色(圖1c)．

4齡幼蟲，頭部呈黃褐色且有光澤； 胸足3對，腹足7對，臀足1對； 體表呈黃綠或淺綠色，臀板呈淡黃褐色，分節(jié)明顯，各節(jié)粗細基本一致(圖1d)．

5齡幼蟲，體表呈深綠色，腹部各節(jié)明顯突起，背側(cè)中部出現(xiàn)較暗線狀斑點； 胸足3對，腹足7對，臀足1對(圖1e)．

6齡幼蟲，此時蟲體長、寬均達到最大值，體表呈深綠色(圖1f)．隨時間增長，蟲體顏色逐漸加深變?yōu)楹诤稚硞?cè)中部線狀斑點呈淺褐色，幼蟲開始縮小．當蟲體縮小至10 mm左右時，蛻皮進入蛹期(圖1g)．期間取食逐漸減少直至無進食，排便也隨之減少．在培養(yǎng)皿內(nèi)不斷爬動尋找遮蔽物，鉆入濾紙下方后靜止不動．

所有蟲齡的幼蟲受驚擾后，尾部左右擺動并翹起，但胸足牢牢抓住葉片不放，并口吐黃綠色汁液．

圖1 黑唇平背葉蜂幼蟲各蟲齡形態(tài)特征

2.2 黑唇平背葉蜂幼蟲的發(fā)育歷期測定

在25 ℃下，幼蟲的發(fā)育歷期為15.33±2.12 d．其中，1～3齡的幼蟲蛻皮時間較為接近，發(fā)育時間較短，分別為1.83±0.75 d，2.10±0.84 d，2.03±0.89 d； 4齡開始蛻皮時間逐漸延長，發(fā)育時間逐漸增加； 6齡時達到最大值，分別為2.17±0.95 d，2.57±0.97 d和4.63±1.50 d (圖2)．

圖2 黑唇平背葉蜂各蟲齡幼蟲的發(fā)育歷期

2.3 黑唇平背葉蜂的生長情況觀察

黑唇平背葉蜂幼蟲在1～3齡時，體長、體寬勻速增長，體長分別為3.05±0.97 mm，4.24±0.45 mm，5.51±1.10 mm，體寬分別為0.46±0.04 mm，0.65±0.09 mm，0.84±0.16 mm．4齡后，幼蟲體長、體寬均較快增長．4齡幼蟲的體長、體寬分別為7.37±1.50 mm，0.98±0.25 mm； 5齡幼蟲體長、體寬顯著增長，此時分別為10.31±1.60 mm，1.49±0.26 mm； 6齡時達到最大，分別為14.21±1.5 mm，2.25±0.26 mm．6齡后期幼蟲蟲體開始縮小并蜷縮至10 mm左右，此時蛻皮進入蛹期(圖3)．

圖3 不同齡期黑唇平背葉蜂幼蟲的體長和體寬變化情況

2.4 黑唇平背葉蜂的危害特征

黑唇平背葉蜂對蕎麥各個品種均有危害，其中多年生苦蕎麥和金蕎麥是主要受害對象．本文中主要描述黑唇平背葉蜂幼蟲以咀嚼式口器對多年生苦蕎的危害，喜食植株嫩葉，一般在開花期及開花前期進行危害，不進食時，幼蟲卷曲在葉片背面休息．危害特征如圖4．黑唇平背葉蜂幼蟲孵出后，1～2齡幼蟲，常群集在葉背取食，形成不規(guī)則的孔洞，但不穿透葉片，留下白色薄膜(圖4a和圖4b)．3齡幼蟲開始主動遷移分散取食但遷移距離不遠，多在附近的3～4葉片間活動取食，穿透葉片形成孔洞(圖4c和圖4d)．4～6齡幼蟲爬行能力顯著增強，開始對整株進行危害(圖4e)； 葉片孔洞逐漸增加，出現(xiàn)失水變干的現(xiàn)象(圖4f)； 嚴重影響光合作用，直至整個植株枯死(圖4g)，繼而轉(zhuǎn)株危害．6齡后期幼蟲不再進食，鉆入土壤蛻皮后進入蛹期(圖4h)．

2.5 黑唇平背葉蜂的取食情況

黑唇平背葉蜂幼蟲取食率隨著齡期的增加而增加．1齡平均日取食量為0.000 24±0.000 05 g； 2齡平均日取食量為0.006 40±0.002 30 g； 3齡幼蟲取食量明顯增大，平均日取食量為0.017 10±0.003 70 g； 4齡幼蟲平均日取食量為0.026 90±0.004 10 g； 5齡幼蟲平均日取食量為0.036 10±0.004 70 g； 幼蟲日取食量在6齡前期時達到最大，平均為0.063 50±0.005 80 g，6齡后期幼蟲取食量迅速降低直至不進食進入蛹期(圖5)．

2.6 4種蟲生真菌菌種對黑唇平背葉蜂幼蟲致病力測定

5株蟲生真菌對黑唇平背葉蜂3齡幼蟲均有一定的致死效果，但不同菌株致死率不同(圖6)．不同蟲生真菌侵染幼蟲10 d后，4號環(huán)鏈蟲草、5號蝙蝠蛾擬青霉致死率較高，分別為58.33%±2.89%，71.67%±2.89%； 2號玫煙色蟲草、3號粉棒束孢致死率較低，分別為51.67%±2.89%，48.33%±5.77%； 1號玫煙色蟲草致死率最低，為45.00%．

圖4 幼蟲危害蕎麥情況

圖5 不同齡期幼蟲對蕎麥葉片的日取食量

小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)．圖6 5株蟲生真菌對黑唇平背葉蜂3齡幼蟲侵染10 d的累計校正致死率

3 結(jié)論

黑唇平背葉蜂幼蟲共6齡，溫度是影響昆蟲發(fā)育歷期的關(guān)鍵因素[25-26]．周傳金等[27]研究發(fā)現(xiàn)在平均溫度為27.4 ℃時發(fā)育時間最短，為8.9 d．本研究中各世代幼蟲的飼養(yǎng)溫度為25 ℃，幼蟲發(fā)育歷期為15.33±2.12 d，原因可能是本實驗在恒定的環(huán)境條件下測定，而周傳金等人所做的實驗為田間環(huán)境，溫度受晝夜影響較大．

黑唇平背葉蜂幼蟲體長、體寬與齡期成正相關(guān)．研究發(fā)現(xiàn)黑翅葉蜂[27]各齡期幼蟲的生長規(guī)律為1～3齡勻速增加，4齡后增長緩慢．本研究中幼蟲的生長在1～3齡較為勻速，4齡后增長更快，可能是由于前者與本研究幼蟲取食的蕎麥品種、溫濕度不同有關(guān)．前者未對幼蟲的體寬進行研究，且所取食的蕎麥品種未公布，因此相關(guān)研究還需進一步驗證．

黑唇平背葉蜂幼蟲的取食危害情況、取食量與齡期成正相關(guān)．Formosempriatakeuchi[28]，Orientabiasinica[29]，Waldheimiasaurauia[30]等葉蜂幼蟲1齡時群居危害葉脈間的相對幼嫩葉片，后期幼蟲危害漸增，啃食整片葉子，形成缺刻．杏絲角葉蜂[31]，Hoplocampatestudinea[32]，西北槌緣葉蜂[33]，杜鵑三節(jié)葉蜂[34]等葉蜂幼蟲3齡前群集危害，3齡后幼蟲分散危害．黑翅葉蜂[27]1～2齡幼蟲平均食葉量較少，3齡后幼蟲食葉量明顯增加，6齡食葉量劇增．本研究中黑唇平背葉蜂幼蟲取食危害情況與黑翅葉蜂較為相似．

蟲生真菌對害蟲有一定的生物防治效果，并且不同的蟲生真菌對同一寄主的致病力存在差異．Ramirez J L等[35]發(fā)現(xiàn)蟲草屬中不同菌種對Aedesaegypti埃及伊蚊致病力不同，當孢子濃度為5.1×105個/mL時C.cateniannulata半致死時間(LT50)為5.14，遠高于C.amoenerosea(LT50=10.28)，與本研究中當孢子濃度為1×108個/mL時，環(huán)鏈蟲草、蝙蝠蛾擬青霉致病力較玫煙色蟲草、粉棒束孢強的結(jié)果相似，導致不同菌種致病力出現(xiàn)差異的原因可能是不同蟲生真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同[24，36-38]．

本實驗首次對黑唇平背葉蜂幼蟲的形態(tài)特征、發(fā)育歷期、生長規(guī)律、取食危害、蟲生真菌致病力方面進行了研究，這將為黑唇平背葉蜂幼蟲的深入了解、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的補充、預(yù)測預(yù)報及綜合治理提供科學依據(jù)，為蟲生真菌作為黑唇平背葉蜂生物防治劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)．

致謝：感謝集美大學魏美才教授對黑唇平背葉蜂的鑒定．