周術(shù)奎，張東亮，王 翔，劉 磊，李 曾，楊盛柯，廖 洪

1. 四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院泌尿外科，四川 成都 610041；2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200080

在全球范圍內(nèi)，前列腺癌是男性第二大常見癌癥，占男性惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的14.1%［1］。高收入國家的前列腺癌發(fā)病率和死亡率近年來處于下降或穩(wěn)定狀態(tài)，但亞洲前列腺癌發(fā)病率快速上升［2］。2020年中國前列腺癌發(fā)病率約為15.6/10萬人，新發(fā)病例超11萬，死亡人數(shù)超5萬［3］。晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌經(jīng)過18～24個(gè)月的內(nèi)分泌治療后最終發(fā)展成去勢抵抗性前列腺癌［4］，預(yù)后較差，這與雄激素受體突變和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，但其機(jī)制仍不明確，因此有必要探究前列腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展和耐藥機(jī)制，以便為晚期前列腺癌治療確立新的靶向策略。腫瘤研究依賴于精確的動(dòng)物模型。目前仍缺乏一種能夠精準(zhǔn)模擬體內(nèi)真實(shí)環(huán)境的前列腺癌動(dòng)物模型，這也是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性前列腺癌耐藥和新藥研發(fā)進(jìn)展緩慢的重要原因之一。

近年來，Pang等［5］和Zhang等［6］利用細(xì)胞懸液注射方式構(gòu)建前列腺癌皮下或原位移植瘤動(dòng)物模型取得成功，其操作簡單、易學(xué)。然而，這種方式存在細(xì)胞懸液滲漏、存活率低、成瘤率不穩(wěn)定、成瘤持續(xù)時(shí)間長等局限性，容易引起移植瘤與原腫瘤內(nèi)環(huán)境“失真”。細(xì)胞膜片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型組織工程技術(shù)，該技術(shù)無需胰酶消化和添加支架材料，連續(xù)體外培養(yǎng)形成膜片狀組織［7］。細(xì)胞膜片技術(shù)能夠完整保留細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），保留細(xì)胞生長的微環(huán)境和生長因子，其組織結(jié)構(gòu)類似于天然組織［8］。因此，細(xì)胞膜片技術(shù)已成為當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，已被應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)修復(fù)重建，包括膀胱［9］和尿道［10］。腫瘤細(xì)胞膜片是通過ECM黏附形成的，可形成多層次結(jié)構(gòu)，而且具備一定力學(xué)強(qiáng)度，使得腫瘤細(xì)胞膜片用于移植瘤成為可能［11-13］。目前國內(nèi)外尚未見利用細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建前列腺癌動(dòng)物模型的相關(guān)研究報(bào)道，本研究利用細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建前列腺癌皮下移植瘤動(dòng)物模型，以細(xì)胞懸液注射作為參照組，并采用組織學(xué)分析評估腫瘤形成效率，以便為前列腺癌動(dòng)物模型提供一種更優(yōu)的選擇。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性BALB/c裸小鼠［6周齡，體重20～25 g，許可證號(hào)為SCXK（滬）2008-0016］購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；飼養(yǎng)動(dòng)物設(shè)施購自上海交通大學(xué)農(nóng)生實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)場有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保持在高效微?？諝膺^濾架的屏障設(shè)施中，具有12 h暗光循環(huán)，并允許自由獲取食物和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照上海交通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行。人前列腺癌細(xì)胞系DU145（HTB-81）購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）；

0.25%胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640培養(yǎng)基和雙抗等均購自美國Gibco公司；35 mm溫度敏感性細(xì)胞培養(yǎng)皿購自美國Thermo Fisher Scientific公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自美國Corning公司；4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）和鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購自美國Sigma公司；馬松三色染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗小鼠單克隆E-cadherin、vimentin、CD31和Ⅰ型膠原抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 前列腺癌DU145細(xì)胞膜片培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞系DU145復(fù)蘇后，重懸在含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。為促進(jìn)細(xì)胞黏附和細(xì)胞膜片形成，預(yù)先以500 μg/mL鼠尾膠原蛋白Ⅰ型包被35 mm溫度敏感性細(xì)胞培養(yǎng)皿，在4 ℃的避風(fēng)條件下保存過夜。當(dāng)培養(yǎng)DU145細(xì)胞達(dá)到95%融合時(shí)，用0.5%胰酶消化，1 000r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)后接種至包被培養(yǎng)皿中連續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7 d即可成膜，于20 ℃培養(yǎng)15 min預(yù)冷后可收獲完整前列腺癌DU145細(xì)胞膜片。

1.3 前列腺癌DU145細(xì)胞膜片鑒定

前列腺癌DU145細(xì)胞膜片用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片5 μm，行H-E染色。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞膜片特異性蛋白E-cadherin、vimentin和膠原纖維，0.5%Triton-X100破膜，1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）常溫封閉切片30 min，然后分別用E-cadherin（1∶500）、vimentin（1∶500）和Ⅰ型膠原免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）兔抗小鼠抗體（1∶500）溫育，4 ℃處理過夜。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌后，將切片與辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶1 000）室溫溫育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，蘇木精復(fù)染，在正置顯微鏡下觀察。

1.4 細(xì)胞膜片皮下移植成瘤

將6只雄性BALB/c裸小鼠隨機(jī)分為2組，每組3只，分為細(xì)胞懸液組和細(xì)胞膜片組。預(yù)先以0.5%胰酶消化單張細(xì)胞膜片，1000r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），重懸后計(jì)數(shù)單張膜片細(xì)胞數(shù)量，約2×106個(gè)。對于細(xì)胞膜片組，將單張細(xì)胞膜片與培養(yǎng)液混合，體積100 μL，注射于裸小鼠左背部近前肢皮下組織，注射后輕壓注射點(diǎn)約30 s。對于細(xì)胞懸液組，當(dāng)培養(yǎng)DU145細(xì)胞達(dá)到95%融合時(shí)，0.5%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)，隨后將與單張細(xì)胞膜片細(xì)胞數(shù)目相等的細(xì)胞懸液100μL注射于裸小鼠左背部近前肢皮下組織，注射后輕壓注射點(diǎn)約30 s。

1.5 皮下移植瘤測量

從移植1周起，每3 d觀察兩組裸小鼠生存及皮下移植瘤的情況，移植4周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，剝離皮下移植瘤，連帶部分周圍組織，并用標(biāo)尺測量移植瘤的最大直徑（a）和最小直徑（b），腫瘤體積計(jì)算公式［14］：V=a×b2×π/6。

1.6 體內(nèi)移植瘤的組織學(xué)分析

用4%多聚甲醛溶液固定移植瘤，石蠟包埋，切片5 μm，行H-E染色。采用免疫組織化學(xué)染色觀察血管標(biāo)志物CD31的表達(dá)情況，0.5%Triton-X100破膜，1%BSA常溫封閉切片30 min，然后分別用CD31兔抗小鼠抗體（1∶500）溫育，4 ℃處理過夜。用PBS洗滌后，將切片與HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶1 000）室溫溫育，DAB染色，蘇木精復(fù)染，在正置顯微鏡下觀察。同時(shí)，根據(jù)說明書流程，利用馬松三色染色試劑盒觀察移植瘤中的膠原蛋白表達(dá)情況，其中膠原纖維組織呈藍(lán)色。

1.7 全身轉(zhuǎn)移情況觀察

皮下注射移植4周后，處理裸小鼠，解剖前列腺癌常見的轉(zhuǎn)移臟器，如移植附近前肢骨、肺和肝臟，大體觀察上述臟器有無結(jié)節(jié)，并進(jìn)行H-E染色，評估兩組在骨、肺和肝臟等全身重要臟器的轉(zhuǎn)移情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量資料以±s表示，組間定量資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌DU145細(xì)胞膜片體外培養(yǎng)與鑒定

前列腺癌DU145細(xì)胞呈多角形或梭形，大小不一，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞輪廓清晰。連續(xù)培養(yǎng)7 d即可成膜，在光鏡下可見細(xì)胞膜片表面大量白色絮狀ECM分布，細(xì)胞緊密連接，細(xì)胞間邊界不清。降低培養(yǎng)溫度后，可完整剝離前列腺癌DU145細(xì)胞膜片，大體觀察呈現(xiàn)半透明膠質(zhì)薄片，表面平滑，質(zhì)地均勻。H-E染色顯示，細(xì)胞膜片由3～5層細(xì)胞組成，厚度為（32.6±7.5）μm（n=3），vimentin和Ⅰ型膠原經(jīng)免疫組織化學(xué)染色呈強(qiáng)陽性，而E-cadherin染色呈陰性（圖1）。

圖1 DU145細(xì)胞膜片培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of DU145 cell sheet

2.2 細(xì)胞膜片皮下移植成瘤與大體觀察

兩組裸小鼠皮下移植后均生存良好，兩組成瘤率均為100%（3/3），均表現(xiàn)為類橢圓形實(shí)性腫塊，移植4周后處死裸小鼠并剝離腫瘤，其中細(xì)胞膜片組移植瘤邊界不清，不易與周圍組織完整剝離。細(xì)胞懸液組移植瘤包膜較完整，易剝離。大體觀察顯示，細(xì)胞膜片組移植瘤體積明顯高于細(xì)胞懸液組，兩組測量腫瘤體積分別為（0.967±0.129）和（0.437±0.054）cm3（t=3.774，P=0.019 5，圖2）。

圖2 細(xì)胞膜片皮下移植成瘤與大體觀察Fig.2 Subcutaneous transplantation tumor formation of cell sheet and gross observation

2.3 體內(nèi)移植瘤的組織學(xué)分析

注射4周后，H-E染色可見細(xì)胞膜片組腫瘤細(xì)胞生長密集，細(xì)胞間連接緊密，較少空泡形成，且腫瘤細(xì)胞浸潤性生長至臨近肌肉組織內(nèi)，組織間分界欠清，而細(xì)胞懸液組細(xì)胞與細(xì)胞間連接普遍松散，腫瘤組織內(nèi)見明顯空泡形成和多發(fā)透明樣改變，部分融合呈液化壞死，且與臨近肌肉組織分界清楚。馬松染色顯示，細(xì)胞膜片組藍(lán)色膠原纖維含量明顯高于細(xì)胞懸液組，兩組光密度值分別為0.023 0±0.001 1和0.014 0±0.000 7（t=7.022，P=0.000 1）。CD31免疫組織化學(xué)染色表明，在200倍顯微鏡視野下細(xì)胞膜片組和細(xì)胞懸液組移植瘤組織中微血管密度（microvascular density，MVD）分別為53.20±3.56和32.40±4.98（t=3.392，P=0.009 5，圖3）。

圖3 體內(nèi)移植瘤組織學(xué)分析Fig.3 Histological analysis of transplanted tumor in vivo

2.4 全身主要器官的轉(zhuǎn)移情況檢測

注射4周后，對全身前列腺癌常見的轉(zhuǎn)移臟器（如骨、肺和肝臟等）進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察未見明顯結(jié)節(jié)或腫塊。H-E染色顯示，兩組的骨、肺和肝臟均未見明顯轉(zhuǎn)移病灶（圖4）。

圖4 全身主要器官轉(zhuǎn)移情況H-E染色Fig.4 H-E staining of major organs in the whole body

3 討 論

利用體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞注射方式構(gòu)建前列腺癌皮下移植瘤動(dòng)物模型一直是初步檢測腫瘤基因表型、研發(fā)抗腫瘤藥物及識(shí)別腫瘤標(biāo)志物的主要方式，但這兩種腫瘤研究方式存在較大缺陷且難以克服，前者缺乏體內(nèi)環(huán)境，后者難以模擬真實(shí)的腫瘤生物學(xué)行為。腫瘤細(xì)胞、ECM及多種細(xì)胞因子是腫瘤微環(huán)境的主要組成部分［15］。前列腺癌細(xì)胞貼壁生長，需要酶消化來獲取腫瘤細(xì)胞懸液，這種方式會(huì)損失相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，并破壞ECM成分，會(huì)不可避免地影響腫瘤細(xì)胞活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而改變腫瘤細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)和表型特征，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室腫瘤研究結(jié)果在向臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用時(shí)困難重重。

DU145細(xì)胞系是首個(gè)前列腺癌細(xì)胞系，于1975年分離自前列腺癌患者的腦轉(zhuǎn)移病灶，為雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞［16］。本研究免疫組織化學(xué)染色提示vimentin高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)，符合DU145細(xì)胞標(biāo)志蛋白特征。本研究發(fā)現(xiàn)，在溫度敏感性細(xì)胞培養(yǎng)皿中預(yù)先包被鼠尾膠原蛋白Ⅰ型對于DU145細(xì)胞膜片的形成至關(guān)重要，否則DU145細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)過程中會(huì)壞死脫落，形成的是細(xì)胞簇而非細(xì)胞膜片。前列腺癌屬于惰性腫瘤，具有細(xì)胞增殖能力相對較弱、生長速度慢和難以成瘤的特點(diǎn)。我們推測，與成纖維細(xì)胞［17］或間充質(zhì)干細(xì)胞［18］等高成膜率細(xì)胞類型相比，DU145細(xì)胞的黏附和擴(kuò)散能力較差，膠原分泌不足，因此需要預(yù)先包被膠原蛋白促進(jìn)其黏附生長。另外，傳統(tǒng)細(xì)胞懸液體內(nèi)注射后，細(xì)胞固定效果較差，常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞滲漏，繼而播散轉(zhuǎn)移。為克服這一局限性，Pavlou等［19］使用Matrigel基質(zhì)膠混合腫瘤細(xì)胞進(jìn)行局部注射，增加細(xì)胞間黏附，以加速腫瘤形成。然而，外源性Matrigel基質(zhì)膠使用的同時(shí)也會(huì)增加注射部位免疫和炎癥反應(yīng)［20］。本研究的細(xì)胞膜片中含豐富ECM，細(xì)胞間緊密連接，注射后很少發(fā)生遷移和細(xì)胞滲漏，最大化地滿足腫瘤原位注射的要求。同時(shí)，這種天然ECM連接而成的細(xì)胞膜片移植后能避免免疫和炎癥反應(yīng)，且不會(huì)引起組織塌陷。

腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞通過分泌可溶性分子或外泌體來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。ECM中的膠原蛋白和纖連蛋白為腫瘤細(xì)胞提供物理支持，同時(shí)也充當(dāng)可溶性因子和外泌體的結(jié)合支架［21］。血管生成是腫瘤生長的必要條件，腫瘤組織內(nèi)MVD越高，則越有助于腫瘤獲得足夠的營養(yǎng)和排出代謝廢物，故抗血管生成藥物在實(shí)體瘤的治療中占據(jù)重要地位。早前研究［22］表明，血管化缺失會(huì)限制實(shí)體瘤生長，在無血管角膜中，腫瘤生長緩慢且呈線性，但血管化后生長迅速且呈指數(shù)增長。ECM和活性因子參與腫瘤誘導(dǎo)的血管生成、血管穩(wěn)定和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞生存［23］。在本研究中，兩組的成瘤率均達(dá)到100%，但細(xì)胞膜片組腫瘤組織內(nèi)MVD明顯高于細(xì)胞懸液組，且膠原纖維含量豐富，能為細(xì)胞膜片中保留ECM和活性因子，促進(jìn)血管再生。同時(shí)，與細(xì)胞懸液組相比，細(xì)胞膜片組腫瘤從宿主組織中獲得了充足氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，成瘤時(shí)間縮短，細(xì)胞緊密連接，空洞較少，腫瘤浸潤周圍結(jié)締肌肉組織，并向組織內(nèi)新形成的血管擴(kuò) 張。

然而，本研究也存在一些局限性：首先，每組裸小鼠數(shù)量太少，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)誤差和真實(shí)世界偏倚；其次，出于動(dòng)物倫理保護(hù)目的，本研究規(guī)定全部裸小鼠移植瘤生長最大直徑不超過2 cm，而前列腺癌是一種惰性腫瘤，局部生長和侵襲性轉(zhuǎn)移進(jìn)展均較緩慢，細(xì)胞移植后觀察時(shí)間不夠長，注射4周后對裸小鼠骨、肺和肝臟等前列腺癌常見的轉(zhuǎn)移臟器進(jìn)行相關(guān)離體檢測，未觀察到明顯的臟器轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，如后續(xù)構(gòu)建轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞膜片動(dòng)物模型，需加大初始移植細(xì)胞數(shù)量或延長移植瘤觀察時(shí)間；最后，本研究主要比較兩種方法體內(nèi)成瘤后在大體方面的差異，如體積、H-E染色、膠原含量及血管形成等，沒有深入解析分子生物學(xué)機(jī)制，有待后續(xù)研究進(jìn)一步全面分析兩種方法構(gòu)建前列腺癌皮下移植瘤模型的差異。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。