陳 璽，曾曉穎，陳佳艷，劉 菲，唐 曦

1.復旦大學附屬華東醫(yī)院腫瘤科，上海 200040；2.上海市靜安區(qū)統(tǒng)戰(zhàn)部，上海 200041

最新數(shù)據(jù)表明，結直腸癌發(fā)病率與死亡率居全球常見惡性腫瘤第3位［1］。在中國結直腸癌發(fā)病率也居惡性腫瘤第3位，死亡率居第5位［2］。由于結直腸癌早期無明顯癥狀，發(fā)展相對緩慢，臨床表現(xiàn)不典型，故在早期容易被忽視。目前臨床上應用較多的預后評估方式有血清腫瘤標志物、術后病理學、影像學等檢查方式。

糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、CA72-4、CA12-5、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是目前在臨床上比較常用的腫瘤標志物，在結直腸癌的預后評估中也具有重要的作用。因各個標志物的特異度和靈敏度均存在較大差異，雖然CEA已經被美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版分期標準作為單獨的預后因素，且證據(jù)等級為Ⅰ級［3］，但腫瘤細胞異質性的存在較為普遍，因此選用單項腫瘤標志物檢測的方式對于結直腸癌的預后判斷往往無法取得理想的效果。研究［4］結果證實，聯(lián)合多項腫瘤標志物檢測的特異度和靈敏度均顯著高于單項檢測，故聯(lián)合檢測對于結直腸癌患者治療方案的選擇、預后的評估均具有重要參考價值。

Ki-67增殖指數(shù)是反映細胞增殖的特異性指標，能比較有效地反映細胞的過度增殖情況，與惡性腫瘤細胞的增殖、轉移密切相關［5］。DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）系統(tǒng)中的基因突變或甲基化，導致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），是導致結直腸癌發(fā)生的重要機制之一［6］。經流行病學調查發(fā)現(xiàn)MSI與10%～15%的散發(fā)性結直腸癌（sporadic colorectal carcinoma，SCC）和90%的Lynch綜合征的發(fā)生、發(fā)展相關。所以MMR與SCC患者臨床表型及預后的關系受到越來越多臨床研究人員的關注。根據(jù)美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）2021年的相關指南，建議對所有結直腸癌患者均進行MSI/MMR檢測［7］?！吨袊Y直腸癌診療規(guī)范（2020年版）》推薦對所有結直腸癌患者進行錯配修復蛋白表達或微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測，用于遺傳性非息肉病性結直腸癌篩查、預后分層及指導免疫治療等［8］。2016年《腫瘤病理診斷規(guī)范（結直腸癌）》中也指出，有條件的單位建議對結直腸癌組織進行錯配修復蛋白檢測，報告錯配修復蛋白表達情況（MLH1、MSH2、MSH6及PMS2），以指導臨床治療和評價預后［9］。

本研究旨在探討免疫組織化學法檢測錯配修復蛋白表達聯(lián)合血清檢測腫瘤標志物與免疫組織化學法檢測Ki-67增殖指數(shù)在結直腸癌中的相關性以及預后判斷的臨床價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取復旦大學附屬華東醫(yī)院2014年7月—2018年6月收治的234例經手術治療的結直腸癌患者的臨床資料，分析其術前血清腫瘤標志物及石蠟包埋組織標本病理學檢查結果。其中男性128例，女性106例，年齡平均68.66歲（39～94歲）。通過電話訪問患者或家屬方式進行隨訪，隨訪起點為手術日期，隨訪截止日期為2020年12月31日，隨訪229例，失訪5例，隨訪率為97.9%，隨訪時間為19～70個月，平均隨訪時間為40.91個月。

入組標準：①術前未接受過放化療；② 均經術前活檢及術后病理學檢查確診為結直腸癌。排除標準：①缺乏完整的臨床資料；② 其他部位惡性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 血清腫瘤標志物檢測

所有患者均通過瑞士羅氏診斷公司生產的電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（Cobas e602）檢測CA19-9、CA72-4、CA12-5和CEA水平，試劑均從羅氏公司購買。檢測方法：患者晨起空腹采肘靜脈血2 mL，分離血清，根據(jù)標準操作流程檢測CA19-9、CA72-4、CA12-5和CEA水平。各項指標的正常值參考范圍：CA19-9為0.0～34.0 U/mL，CA72-4為0.0～8.2 U/mL，CA12-5為0.0～35.0 U/mL，CEA為0.0～5.0 ng/mL。

1.2.2 Ki-67增殖指數(shù)與錯配修復蛋白檢測

所有患者結直腸癌術后組織標本采用二步法Envision System法檢測Ki-67增殖指數(shù)、4種錯配修復蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）的表達情況。Ki-67增殖指數(shù)判斷：Ki-67免疫涂色定位于細胞核，呈棕黃色顆粒視為陽性，Ki-67增殖指數(shù)按陽性細胞所占百分比表示。錯配修復蛋白結果判斷：定位于細胞核，細胞核著色視為陽性表達，未著色為缺失，其中MLH1、MSH2、MSH6、PSM2均陽性表達判定為表達正常（proficient mismatch repair，pMMR），任意一項染色缺失判定為表達缺失（deficient mismatch repair，dMMR）。

1.3 評價指標

統(tǒng)計患者術前血清CEA、CA19-9、CA72-4、CA12-5水平及手術標本組織中的Ki-67增殖指數(shù)與錯配修復蛋白的表達，分析上述指標與結直腸癌臨床病理學特征［性別、年齡、腫瘤原發(fā)病灶部位、腫瘤分化程度、TNM分期（按AJCC第8版分期標準進行分期）、淋巴結轉移、淋巴管血管侵犯、神經侵犯等］及患者預后的關系。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件對資料進行分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。各組數(shù)據(jù)相關性分析采用Spearman相關分析法。采用Kaplan-Meier法對各個因素的生存預后進行單因素分析，并繪制生存時間曲線。組間的差異性檢驗采用log-rank檢驗。多因素分析采用Cox比例風險模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 錯配修復蛋白表達與患者各項基本病理學參數(shù)及觀察指標的關系

在234例結直腸癌患者術后標本中發(fā)生dMMR的共29例（12.4%），pMMR的有205例（87.6%），按此分為2組，進行χ2檢驗。

pMMR組與dMMR組在腫瘤原發(fā)部位、分化類型、分期、T分期、淋巴結轉移方面的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），主要表現(xiàn)為dMMR組較pMMR組更多見于右半結腸癌，在低分化腺癌及黏液腺癌中多見，T分期較晚（T3、T4比例高），但總體分期較早（以Ⅱ期為多），淋巴結轉移較少見。而兩組患者的性別、年齡和有無神經、淋巴管血管侵犯差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

而在觀察指標方面，234例患者中Ki-67增殖指數(shù)采用50%為分界點，＞50%分為Ki-67高陽性率組，而≤50%為Ki-67低陽性率組。術前血清腫瘤標志物水平按正常參考值分為術前正常組與術前升高組。

采用χ2檢驗分析后，pMMR組與dMMR組在Ki-67增殖指數(shù)、術前CEA、CA72-4的水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與術前CA19-9、CA12-5的水平相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 錯配修復蛋白表達與患者各項基本病理學參數(shù)及觀察指標的關系Tab.1 Relationship between mismatched repair protein expression and basic pathological parameters and observed indicators of patients

2.2 單因素預后分析

預后隨訪中，234例中5例失訪，共229例患者隨訪成功?；颊呋九R床病理學因素與預后分析中，淋巴結轉移組，分期較晚組生存率低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。而在性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、分化類型、T分期各組別中差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。錯配修復蛋白dMMR組患者的生存率為100%（29/29），pMMR組的生存率為83%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ki-67增殖指數(shù)低陽性率組患者的生存率為91.5%，高陽性率組的生存率為82.9%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。術前CEA、CA72-4正常與升高組的患者生存率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其余各組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2、圖1）。

圖1 不同情況下生存分析Fig.1 Survival analysis of different items

表2 單因素預后分析Tab.2 Univariate prognostic analysis

2.3 多因素預后分析

單因素分析顯示，錯配修復蛋白表達、淋巴結轉移、分期、術前CEA、術前CA72-4水平均為影響結直腸癌患者預后的因素。多因素COX回歸分析結果顯示，錯配修復蛋白表達、淋巴結轉移、術前CEA與患者預后無顯著相關，分期與術前CA72-4水平與預后顯著相關（P＜0.05，表3），提示較晚的分期和術前CA72-4水平升高是影響患者預后的獨立危險因素。

表3 預后影響因素的多因素COX回歸分析Tab.3 Multivariate COX regression analysis of prognostic factors

3 討 論

結直腸癌作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，一般認為是由飲食習慣、生活方式、生活環(huán)境以及遺傳因素等多因素共同作用下導致的結果，但是具體的發(fā)病機制仍未明確。

由于在世界范圍內結直腸癌的發(fā)病率及死亡率依舊處于逐漸上升的趨勢，作為結直腸癌重要發(fā)生機制之一的MMR系統(tǒng)的基因突變或甲基化，越來越受到臨床醫(yī)生及研究者的重視。

MMR系統(tǒng)的主要作用是在正常細胞增殖過程中，當細胞DNA在復制中出現(xiàn)堿基配對錯誤（正常細胞復制中最容易出現(xiàn)錯配的是微衛(wèi)星序列）時，MMR系統(tǒng)可以識別并糾正錯配的堿基，保持基因轉錄翻譯的穩(wěn)定性，避免腫瘤的發(fā)生。而一旦MMR系統(tǒng)中的基因發(fā)生了突變或甲基化，就會導致細胞基因組穩(wěn)定性下降，產生MSI，MSI使得正常的基因發(fā)生突變并使某些癌基因或突變的抑癌基因不斷累積，最終導致機體產生腫瘤。

目前發(fā)現(xiàn)的MMR蛋白共有9種，正常時MMR蛋白無缺失稱為pMMR，而當MMR系統(tǒng)中的基因發(fā)生突變或甲基化后，會導致相對應的MMR蛋白出現(xiàn)表達缺失，即為dMMR。其中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6蛋白表達缺失是臨床最為常見的dMMR類型，而MMR系統(tǒng)中的基因突變導致任意一種dMMR均會引發(fā)MMR系統(tǒng)功能障礙，導致MSI發(fā)生［10］。

國內外指南均推薦檢測組織MMR和MSI狀態(tài)［7-9］。不過由于MSI基因突變檢測費用比較昂貴限制了其臨床應用，而免疫組織化學檢測法檢測MMR蛋白表達因其費用較低，且具有高度敏感性和特異性，與MSI基因突變檢測的一致性較高，所以近年來大多采用免疫組織化學法作為首選的方案對患者的手術標本MMR蛋白進行檢測來預測MSI狀態(tài)。最常見的免疫組織化學法檢測結果是MSH2和MSH6染色正常，而MLH1和PMS2同時缺失，表明患者可能是Lynch綜合征相關的結直腸癌或錯配修復基因蛋白缺失的散發(fā)性結直腸癌。

本研究結果顯示，在234例結直腸癌患者術后標本中發(fā)生dMMR的共有29例（12.4%），pMMR的有205例（87.6%），dMMR發(fā)生率與之前的研究結果相近［11］。在本研究臨床病理學指標的相關性分析中dMMR組與pMMR組在腫瘤原發(fā)部位、分化類型、分期、T分期、淋巴結轉移方面的差異有統(tǒng)計學意義，提示dMMR更多見于右半結腸癌患者，低分化及黏液腺癌為多，分期相對較早（Ⅱ期偏多），腫瘤浸潤深度較深（T3、T4），淋巴結轉移發(fā)生較少，提示MMR檢測對于結直腸癌患者的風險和預后評估有一定的意義。在單因素預后分析中dMMR組與pMMR組的生存率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示dMMR組患者較pMMR組患者預后更好，這與另一項納入了2 940例根治性切除術后結直腸癌患者的臨床試驗結果相一致，dMMR導致MSI高的患者預后較好［12］。

血清腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA72-4、CA12-5是目前臨床診療中常用的腫瘤標志物，廣泛地應用于肺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤的診斷與預后判斷中。雖然國內外的一些研究［13-15］都分別提示CEA、CA19-9、CA72-4、CA12-5有助于結直腸癌術前診斷、療效評價及預后判斷，但單一標志物的特異性都不高，需要通過聯(lián)合檢測來提高預測結直腸癌轉移和復發(fā)的準確性［16-18］。

Ki-67增殖指數(shù)與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、區(qū)域淋巴結轉移及臨床分期有關［19-20］。本研究顯示，pMMR組與dMMR組在Ki-67免疫染色陽性率、術前CEA、CA72-4的水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與術前CA19-9、CA12-5的水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。具體表現(xiàn)為dMMR組患者的Ki-67增殖指數(shù)大多≤50%，術前CEA正常水平者較多，術前CA72-4水平升高者較多。而在單因素預后分析中術前Ki-67增殖指數(shù)及CEA、CA72-4表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示術前CEA、CA72-4水平升高是影響結直腸癌患者預后的危險因素。

本研究通過單因素分析得到影響結直腸癌患者預后的5項變量，然后進行多因素預后分析，其中錯配修復蛋白表達、淋巴結轉移與患者預后無顯著相關，而分期及術前CA72-4水平與預后顯著相關（P＜0.05），提示較晚的分期和術前CA72-4水平升高是影響患者預后的危險因素。

綜上所述，錯配修復蛋白表達缺失與臨床病理學參數(shù)（腫瘤原發(fā)部位、分化類型、分期、T分期、淋巴結轉移）具有明顯相關性。錯配修復蛋白表達缺失在Ki-67增殖指數(shù)、術前血清CEA與CA72-4的水平上與錯配修復蛋白正常表達差異有統(tǒng)計學意義，對于結直腸癌患者的預后評估具有一定的意義。

但由于本研究的病例數(shù)仍偏少，且錯配修復蛋白表達缺失率本就不高，這可能造成偏倚，影響了統(tǒng)計學結果的可信度。在今后的研究中，可調整研究方案設計，嘗試前瞻性研究，并擴充樣本量，納入術后治療方案作為評價預后的參考指標之一，減少系統(tǒng)性偏差。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。