薛婷 晏如 韓輝

陰莖癌是一種較為罕見的惡性腫瘤，主要病理類型為陰莖鱗狀細胞癌(penile squamous cell carcinoma, PSCC)。美國約每100 000男性中存在0.5～2.1例患者，在亞洲、非洲和南美洲等地方，其發(fā)病率約占男性所有惡性疾病的1%～2%[1-2]。約有1%～2%的陰莖癌患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)固定、腹股溝淋巴結(jié)腫大或盆腔淋巴結(jié)腫大，繼而擴散至全身部位。腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率為20%～40%，發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率低至0%，預(yù)后較差[3]。Pagliaro等[4]報道局部晚期陰莖癌患者TIP方案(紫杉醇+異環(huán)磷酰胺+順鉑)的客觀反應(yīng)率為50%，是各類指南推薦的標(biāo)準治療方案。也有研究者對其他的治療方案進行了探索，如Djajadiningrat等[5]報道TPF方案(多西他賽+順鉑+5-氟尿嘧啶)的2年無進展生存率(progression free survival, PFS)和疾病特異性生存率(disease free survival, DSS)分別為12%和28%。但由于毒性過大，而限制了其在臨床的應(yīng)用。

近年來，免疫檢查點抑制劑的運用開辟了腫瘤治療的新歷史。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)與免疫治療的效果高度相關(guān)，相關(guān)的生物標(biāo)志物也可用來預(yù)測免疫治療的療效。越來越多的證據(jù)表明TME中的各種成分(成纖維細胞、細胞外基質(zhì)、內(nèi)皮細胞和免疫細胞等)是腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要組成部分，腫瘤的微環(huán)境特征對于評估預(yù)后情況也有一定的價值[6]。本文從調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的角度分析目前新型免疫治療策略的應(yīng)用，有望為優(yōu)化晚期患者的免疫治療方案提供參考依據(jù)。

一、TME

1.腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)：TILs包括CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞和NK細胞等，高水平的TILs顯著提高了乳腺癌患者新輔助化療的敏感性和療效，與腫瘤特異性生存率呈正相關(guān)[7]。TILs能夠反映出腫瘤的免疫應(yīng)答和調(diào)控作用的趨勢，參與癌癥免疫編輯和免疫逃逸過程的作用而被廣泛研究[8]。

2.CD8+T淋巴細胞：CD8+T淋巴細胞在識別抗原后分化為細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)，通過向免疫突觸釋放顆粒酶、穿孔素等細胞毒分子、分泌干擾素和腫瘤壞死因子等細胞因子，殺死攜帶目標(biāo)抗原的細胞，進一步加速對細胞內(nèi)病原體的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。CD8+T淋巴細胞作為抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)因子，在腫瘤細胞的適應(yīng)性免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。Ottenhof等[10]對荷蘭癌癥研究所就診的213例陰莖癌患者進行了回顧性研究。結(jié)果表明，基質(zhì)內(nèi)CD8+T細胞數(shù)量較少的患者，易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；與Harada等[11]在直腸癌中報道的一致。

3.調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cell, Treg)：Treg受特定抗原刺激后，可產(chǎn)生多種抑制性細胞因子(IL-10、TGF-β、CTLA-4等)以達到增強Treg細胞的免疫抑制能力，同時這些因子又可以反饋調(diào)節(jié)誘導(dǎo)Treg細胞的產(chǎn)生。部分Treg細胞表達顆粒酶B和穿孔素以攻擊靶細胞。多種機制聯(lián)合導(dǎo)致活化T細胞失活抑制機體的抗腫瘤免疫功能，促進腫瘤的進展。Treg細胞表達特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，可作為識別Treg細胞的標(biāo)志[12]。Vassallo等[13]通過免疫組化陰莖癌石蠟包埋組織的p16蛋白、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68、CD138、顆粒酶B和Foxp3+進行檢測。結(jié)果顯示Foxp3+淋巴細胞水平能夠獨立預(yù)測預(yù)后情況。Cocks等[14]隨訪了53例局部晚期的陰莖癌患者，發(fā)現(xiàn)晚期陰莖癌患者中的CD8+T/Foxp3+Treg比值有明顯減少的趨勢，陰莖癌伴高水平腫瘤浸潤的Foxp3+Treg細胞無病生存幾率更低；表明Foxp3可能是一個免疫治療療效差的生物標(biāo)記物。

4.腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)：TAMs多為外周血單核巨噬細胞分化而來，是TME中浸潤的主要炎癥細胞之一。TAMs分為干擾素γ和脂多糖刺激產(chǎn)生的M1型巨噬細胞(CD68)和IL-4和IL-13等誘導(dǎo)產(chǎn)生M2型巨噬細胞(CD163)。M1型TAMs主要起到殺傷細胞、抑制腫瘤細胞發(fā)展和促進適應(yīng)性免疫反應(yīng)的作用。而M2型TAMs通過在基底膜破裂和沉積、血管生成、白細胞募集和免疫抑制的作用，促進腫瘤的發(fā)展[15]。TAMs可以重塑腫瘤免疫抑制環(huán)境，分泌的免疫抑制性細胞因子或蛋白酶會誘導(dǎo)程序性細胞死亡-配體1(programmed death receptor-ligand 1, PD-L1)PD-L1在癌細胞中過表達并激活相關(guān)的信號通路，加速腫瘤進展。在陰莖癌中，高CD68+TAMs浸潤的患者，腫瘤特異性生存情況有明顯的改善、總生存期長和局部復(fù)發(fā)風(fēng)險降低[16]。另一項陰莖癌的研究表明，陰莖癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CD163+TAMs的浸潤程度相關(guān)[10]。TAMs在TME中發(fā)揮了重要的作用，但兩種TAMs的作用機制不同。因此，區(qū)分何種TAMs在TME中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵。M1型還是M2型TAMs是免疫治療的關(guān)鍵之處。

5.免疫分型：Zhang等[17]收集了來自8例肝細胞癌患者的42份樣本。通過CD45和Foxp3的表達情況，將實體腫瘤在組織學(xué)上分為3種腫瘤免疫表型：①免疫活性亞型：CD45高表達Foxp3低表達，該亞型中免疫細胞較多，存在一定的抗腫瘤免疫能力，預(yù)后較好。然而，其浸潤性T細胞的抗腫瘤功能相對較低，需要被進一步激活，所以T細胞反應(yīng)激活劑(如IL-12和CpG 寡核苷酸)和ICIs的聯(lián)合使用能夠使此類患者獲益；②免疫抑制亞型：CD45高表達Foxp3高表達，這一類型的TME內(nèi)存在大量的免疫細胞浸潤，但免疫環(huán)境可能受到抑制，此時應(yīng)用免疫檢查點抑制劑可以恢復(fù)抗腫瘤效應(yīng)；③免疫缺陷亞型：CD45低表達，腫瘤實質(zhì)或間質(zhì)內(nèi)幾乎完全缺乏T細胞。程序性細胞死亡1(programmed death receptor-1, PD-1)/PD-L1抑制劑無法在此表型中發(fā)揮作用，如何誘導(dǎo)產(chǎn)生更多腫瘤特異性T細胞是改善該表型抗腫瘤作用的關(guān)鍵步驟[18]。

Troiano等[19]對口腔舌鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the oral tongue, OTSCC)的免疫表型進行了分析。發(fā)現(xiàn)免疫沙漠型腫瘤患者的疾病特異性生存期(HR=2.673)、總生存率(HR=2.591)和無病生存期(HR=2.313)均較差。該研究表明免疫沙漠型是OTSCC患者預(yù)后不良的一個評估因素。以上結(jié)果表明，腫瘤免疫表型可以作為指導(dǎo)選擇合適治療方法的工具，也可以作為評估患者預(yù)后的一個指標(biāo)。但目前在陰莖癌中還缺少對免疫分型的研究。

二、預(yù)測免疫治療效果的生物標(biāo)志物

1.腫瘤突變負荷(tumor mutational burden, TMB)：TMB是指腫瘤細胞編碼區(qū)每Mb DNA的非同義體細胞突變的數(shù)量。高頻率體細胞突變的發(fā)生可能導(dǎo)致新抗原的產(chǎn)生，誘導(dǎo)腫瘤表達大量異常蛋白，這些異常蛋白被免疫系統(tǒng)識別為新抗原，從而引起抗腫瘤免疫反應(yīng)。因而，TMB高提示產(chǎn)生的新抗原多，應(yīng)用免疫檢查點抑制劑釋放的T細胞更有可能識別新抗原，從而達到攻擊和殺死腫瘤的作用。美國食品和藥物管理局已經(jīng)批準了pembrolizumab用于TMB≥10 Muts/Mb的不可切除或轉(zhuǎn)移性成年和小兒實體瘤患者[20]。

CheckMate-032試驗[21]納入了401名一線治療失敗的晚期肺癌患者，分兩組比較接受Nivolumab單藥治療和Nivolumab與Ipilimumab聯(lián)合治療效果的差異。對組織進行靶向基因組測序計算TMB，分為高、中、低3組評估治療情況。結(jié)果顯示，TMB高的人群有效率是中、低組的3倍；TMB高組患者的總生存期比低組延長了19個月。Chahoud等[22]對2例初始治療失敗的陰莖癌患者采用派姆單抗治療。分別檢測2例患者的TMB情況，病理完全緩解患者的TMB為14 Muts/Mb，另一位部分緩解患者的TMB值為3 Muts/Mb。以上結(jié)果表明，TMB可能是預(yù)測患者免疫治療療效的一個因素。但TMB與免疫治療應(yīng)答的關(guān)系仍有待進一步探討。

2.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性：微衛(wèi)星序列在復(fù)制過程中極易發(fā)生復(fù)制錯誤，導(dǎo)致一個或多個堿基的錯配、插入、缺失，發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)，使得大量突變在細胞內(nèi)累積，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。DNA錯配修復(fù)是一種重要的DNA錯配修復(fù)機制，能識別及修復(fù)在DNA復(fù)制或重組過程中產(chǎn)生的DNA錯配，小范圍的堿基缺失或插入，對維持基因組穩(wěn)定性、遺傳后代的精確性有著重要的作用。腫瘤組織出現(xiàn)MSI現(xiàn)象是DNA錯配修復(fù)缺陷的重要標(biāo)志[23]。

頭頸部鱗癌、肛門鱗癌中MSI-H的發(fā)生率約為0.78%。但是在宮頸鱗癌MSI-H的發(fā)生率約為11%[24]。Stoehr等[24]通過免疫組化等方式檢測了105例陰莖癌患者錯配修復(fù)蛋白表達的情況。結(jié)果表明，錯配修復(fù)蛋白全部表達，沒有MSI的證據(jù)。以上結(jié)果表明，MSI和dMMR在不同癌種間的差距較大，并不是陰莖癌的常規(guī)特征，能否作為陰莖癌PD-1/PD-L1療效預(yù)測的生物標(biāo)志物有待驗證。

3.PD-1/PD-L1表達：近年來的研究表明，T淋巴細胞的活化情況與免疫檢查點有著密切的關(guān)系。T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在某種條件下被抑制，腫瘤發(fā)生免疫逃逸并迅速生長、轉(zhuǎn)移。免疫檢查點包括：①PD-1和PD-L1；②細胞毒素T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)[25]。T細胞的表面的PD-1蛋白與腫瘤細胞的PD-L1/PD-L2蛋白結(jié)合后，提供抑制性信號，誘導(dǎo)了T細胞凋亡、抑制T細胞的活化和增殖，使腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。約在40%～60%的陰莖癌患者中能夠檢測到PD-L1的表達[26]。Udager等[27]對37例陰莖癌患者進行了免疫組織化學(xué)分析研究，結(jié)果顯示，37例原發(fā)腫瘤中23例(62.2%)PD-L1表達呈陽性，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中PD-L1的表達呈正相關(guān)。原發(fā)腫瘤的PD-L1表達與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.024)，與癌癥特異性生存率降低(P=0.011)亦顯著相關(guān)。大多數(shù)原發(fā)性陰莖癌腫瘤表達PD-L1，其高表達與高風(fēng)險的臨床病理特征和較差的臨床結(jié)局有關(guān)。這些數(shù)據(jù)為進一步研究抗PD-1和抗PD-L1免疫療法在晚期陰莖鱗癌患者中的作用提供了理論依據(jù)。

4.CTLA-4 表達：CTLA-4的作用與PD-1/PD-L1類似，CTLA-4與B7分子結(jié)合后誘導(dǎo)T細胞失活，免疫反應(yīng)受到抑制，可以幫助實體腫瘤逃避宿主的抗腫瘤免疫。Karpathiou等[28]檢測了152例頭頸鱗狀細胞癌患者的CTLA-4水平，結(jié)果顯示，腫瘤組織高表達CTLA-4的患者無進展生存期(progression free survival, PFS)及總生存期分別為19個月和32個月，而低表達CTLA-4的患者為42個月和48個月。表明腫瘤CTLA-4的表達情況是評估腫瘤患者預(yù)后的一個因素。

三、人類乳頭狀瘤病毒與免疫微環(huán)境關(guān)系

多項研究顯示，陰莖癌的發(fā)病和預(yù)后可能相關(guān)的因素之一為人類乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染，由于受病毒分子檢測方式、種群的影響，文獻報道的陰莖癌患者HPV的感染率差異較大。25%～50%的陰莖癌患者存在HPV病毒感染，其中又以攜帶高危型HPV 16型和18型占絕大多數(shù)[29]。

HPV調(diào)控陰莖癌的TME也是增強免疫治療值得關(guān)注的領(lǐng)域。在一項對陰莖癌患者組織免疫組化標(biāo)志物的研究中，HPV陽性患者的CD8+T細胞水平明顯高于HPV陰性患者，表示HPV對陰莖癌的TME有顯著影響[16]。此外，Lyford等[30]報道，70%的HPV相關(guān)頭頸部鱗癌在腫瘤細胞和CD68+TAMs上均表現(xiàn)為免疫抑制分子PD-L1陽性表達，提示在這些患者中使用免疫檢查點抑制劑可能獲益。Lohneis等[31]進行的一項薈萃分析顯示，HPV陽性的陰莖癌患者的腫瘤浸潤T細胞的平均數(shù)量高于HPV陰性的陰莖癌患者，基質(zhì)T淋巴細胞明顯少于HPV陰性患者。同時還發(fā)現(xiàn)HPV陽性的陰莖癌患者中有更多的腫瘤浸潤Treg，這可能代表了一種免疫逃避機制，并解釋了T細胞無法清除腫瘤的原因。

由于陰莖癌患者較少，免疫相關(guān)研究目前報道較少。有限的文獻數(shù)據(jù)表明，HPV陽性陰莖癌患者的TME不同于HPV陰性患者，推測免疫抑制劑可能在兩個群體中存在治療療效的差異。

四、免疫治療相關(guān)的個案報道

Hahn等[32]報道了3例應(yīng)用pembrolizumab抑制劑治療轉(zhuǎn)移性陰莖癌，皆為經(jīng)歷一線化療及手術(shù)治療失敗的患者，疾病進展后對患者施行免疫檢查點抑制劑治療。A患者接受了6個周期的pembrolizumab治療后，腫瘤體積縮小了34%；B患者在兩個周期的pembrolizumab治療后，CT掃描顯示，他的左側(cè)腹股溝淋巴結(jié)增大50%。C患者在接受3個周期的pembrolizumab治療后，可測量病灶增加了172%，并出現(xiàn)了多個新部位的疾病。

Baweja等[33]對1例晚期的陰莖癌患者使用Ipilimumab聯(lián)合Nivolumab。免疫治療前腫瘤大小約為12.7 cm×13.8 cm×18.3 cm，接受2個療程免疫治療后，CT結(jié)果顯示僅剩1.2 cm的壞死腫塊，同時該患者癌癥的相關(guān)不良癥狀逐漸消失。表明對于PD-1/PD-L1效果不佳的患者，聯(lián)合免疫治療也可能成為新的治療方向。以上結(jié)果表明，PD-1/PD-L1抑制劑在陰莖癌的治療中具有一定的理論基礎(chǔ)及應(yīng)用前景。精準識別對免疫檢查點抑制劑獲益的人群或生物標(biāo)記物是臨床研究的熱點。

五、目前正在進行中的免疫相關(guān)陰莖癌注冊臨床試驗

拉丁美洲腫瘤學(xué)合作組織與默沙東聯(lián)合發(fā)起了一項Ⅱ期臨床試驗(NCT04224740)，主要研究晚期陰莖癌患者中以順鉑為基礎(chǔ)的化療聯(lián)合pembrolizumab作為一線全身方案的療效。Dana-Farber癌癥研究所與施貴寶制藥聯(lián)合發(fā)起了一項Nivolumab+Ipilimumab用于晚期罕見泌尿生殖器腫瘤的研究(NCT03333616)。美國國立癌癥研究所與國立衛(wèi)生研究院臨床中心攜手開展了M7824(NCT03427411)治療HPV相關(guān)的惡性腫瘤的臨床研究(M7824是一種新型的雙功能融合蛋白，該蛋白由靶向PD-L1蛋白的IgG1單克隆抗體和TGF-β受體Ⅱ型融合而成)。以上研究目前仍在招募患者中，相信最終研究的結(jié)果能夠改善陰莖癌治療現(xiàn)狀[34]。

國內(nèi)也在陸續(xù)開展免疫治療相關(guān)的臨床試驗。北京市朝陽區(qū)桓興腫瘤醫(yī)院開展了陰莖癌化療聯(lián)合免疫治療(PD-L1/PD-1)療效及安全性的單臂前瞻性研究。該研究納入了局部晚期或遠處轉(zhuǎn)移陰莖癌無手術(shù)適應(yīng)癥的患者，采用白蛋白紫杉醇+順鉑+博來霉素全身化療方案聯(lián)合PD-1單抗(替雷利珠單抗注射液)治療，評估入組患者的客觀緩解率、PFS、總生存期及不良反應(yīng)發(fā)生率。

中山大學(xué)腫瘤防治中心也正在開展一項針對局部晚期陰莖癌患者新輔助治療的Ⅱ期臨床研究(NCT04475016)，主要方案為TIP化療聯(lián)合特瑞普利單抗和尼妥珠單抗，用于T4/N3陰莖癌患者的新輔助治療的單臂開放標(biāo)簽的研究，目前正處于患者入組階段。主要研究終點為病理完全緩解率，該臨床試驗的結(jié)果也值得期待。

六、展望

陰莖癌的免疫微環(huán)境研究可以深入了解陰莖癌轉(zhuǎn)移和發(fā)展的免疫學(xué)規(guī)律，為免疫治療策略制定指明方向。對于局部晚期的陰莖癌，指南中仍主要推薦手術(shù)及化療作為陰莖癌的治療手段。初步的探索和少量病例治療觀察顯示，免疫檢查點抑制劑在晚期陰莖癌的治療中具有一定的應(yīng)用前景。免疫治療和靶向治療單獨或聯(lián)合用于轉(zhuǎn)移性陰莖癌的多項注冊臨床研究正在進行中。通過外顯子組測序、轉(zhuǎn)錄組測序及病理學(xué)檢測等多種方式，為不同特征的患者群體制定個性化的精準醫(yī)療，是日后研究的主要方向。