龍艷春，朱佳斌，孫歡，鄭旭，尚發(fā)軍

三峽大學附屬仁和醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 宜昌 443000

膠質瘤約占成人中樞神經(jīng)系腫瘤的80%，具有高發(fā)病率、高復發(fā)率、高死亡率的特點[1]。目前臨床上治療膠質瘤主要采取手術切除后輔以放療和化療的治療方法，但效果差，中位生存期僅為14.6 個月[2]。因此，迫切需要尋找新的治療膠質瘤的方法。尼莫司汀是一種能夠通過血腦屏障的亞硝脲類藥物，具有烷化作用，廣泛用于膠質瘤的治療。然而，約半數(shù)以上的膠質瘤對尼莫司汀耐藥[3]。褪黑素是由腦松果體分泌的激素，可增強多種化療藥物的療效[4-7]。因此，本研究擬在膠質瘤U118 細胞中觀察褪黑素對尼莫司汀化療增敏效應，嘗試通過體外實驗闡述其機制，為這兩種藥物相結合治療膠質瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人膠質瘤U251細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Typeculture Collection，ATCC)；DMEM 培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries 公司)；青-鏈霉素雙抗(上海碧云天生物技術有限公司)；CCK-8 (美國Bimake 公司)；反轉錄試劑盒(日本TaKaRa 公司)；Talent 熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；COX-2 抗體、GAPDH 抗體、p-IB 抗體和IB 抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) DMEM 培養(yǎng)基+質量分數(shù)為10%胎牛血清+質量分數(shù)為1%青-鏈霉素雙抗，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8 實驗 取對數(shù)生長期U118 細胞，按5000/孔接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 后，實驗組中分別加入含不同濃度褪黑素和(或)尼莫司汀培養(yǎng)液，每組設3個復孔。培養(yǎng)48 h后，除去上清培養(yǎng)基，加入新鮮的含10%CCK-8的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，于酶標儀450 nm 波長處檢測各孔的吸光度A值。細胞存活率(%)=(實驗組平均A 值/對照組平均A 值)×100%。

1.4 協(xié)同實驗 實驗分為四組，即對照組、褪黑素組(0.75 mmol/L)、尼莫司汀組(100 μmol/L)、聯(lián)合治療組(0.75 mmol/L褪黑素聯(lián)合100 μmol/L 尼莫司汀)，通過CCK-8 實驗檢測各組吸光度。兩藥相互作用指數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI) 的計算公式為:CDI=AB/(A×B)。AB 為聯(lián)合治療組與對照組吸光度值(450 nm)的比值，A 或B 是各藥物單獨使用組與對照組吸光度值(450 nm)的比值。當CDI＜1 時，兩藥有協(xié)同作用。

1.5 平板克隆實驗 取對數(shù)生長期U118 細胞，以每孔1000 個U118細胞接種至6孔板中。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 后，實驗組中分別加入含不同濃度褪黑素和(或)尼莫司汀培養(yǎng)液。48 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 周后，吸出培養(yǎng)基，并用PBS 洗3 次，晾干后用結晶紫染色。

1.6 COX-2 mRNA水平檢測 各組加藥處理48 h后，按反轉錄試劑盒說明書的步驟操作，以多聚A尾法對目的基因進行反轉錄，反轉錄產(chǎn)物加入COX-2 與GAPDH的基因引物，使用Talent熒光定量檢測試劑盒進行Real-Time PCR 反應。采用2-ΔΔCT法進行相對定量。GAPDH 的引物序列為：5'-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3' (forward)；5'-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3'(reverse)；COX2 的引物序列為：5'-CAG CCA TAC AGC AAA TCC TTG-3'(forward)；5'-CAA ATG TGA TCT GGA TGT CAA C-3'(reverse).

1.7 Western blot 檢測蛋白表達 各組加藥處理48 h 后，按照常規(guī)辦法提取總蛋白，經(jīng)蛋白定量后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜5%脫脂奶粉封閉2 h，加入COX-2(1∶500)、β-actin(1∶2000)、p-IB(1∶500)、IB(1∶1000)，輕搖過夜，TBST洗3次，ECL化學發(fā)光液顯色檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或析因設計方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素聯(lián)合尼莫司汀對U118細胞存活率的影響 CCK-8實驗中，與對照組比較，褪黑素、尼莫司汀單獨或者協(xié)同給藥處理對U118 細胞均有明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。協(xié)同實驗中，褪黑素(0.75 mmol/L)聯(lián)合尼莫司汀(100 μmol/L)時，U118 細胞的CDI為0.43。因此，選取0.75 mmol/L褪黑素和100 μmol/L 尼莫司汀作為后續(xù)實驗的給藥濃度。平板克隆實驗中，與尼莫司汀組比較，聯(lián)合治療組中U118細胞的克隆形成能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖1 褪黑素和尼莫司汀單獨及聯(lián)合對U118細胞存活率的影響

圖2 褪黑素聯(lián)合尼莫司汀對U118細胞克隆形成的影響(×1，結晶紫染色)

2.2 褪黑素聯(lián)合尼莫司汀對U118細胞中COX-2表達的影響 與尼莫司汀組比較，聯(lián)合治療組U118細胞中COX-2 mRNA 和蛋白水平均明顯降低, 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3和圖4。

圖3 褪黑素聯(lián)合尼莫司汀對U118細胞中COX-2蛋白表達的影響

圖4 褪黑素聯(lián)合尼莫司汀對U118細胞中COX-2 mRNA表達的影響

2.3 褪黑素聯(lián)合尼莫司汀對NF-κB信號通路的影響 與尼莫司汀組比較，聯(lián)合治療組中p-IB/IB的水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖5 褪黑素聯(lián)合尼莫司汀對NF-κB信號通路的影響

3 討論

尼莫司汀是膠質瘤一線標準化療方案的組成部分。但是，高劑量的尼莫司汀會產(chǎn)生諸如骨髓抑制、間質性肺炎、肺纖維化、消化道反應等不良反應，并且某些膠質瘤患者對尼莫司汀的治療表現(xiàn)出抗性[3]。目前已經(jīng)有多項研究表明，尼莫司汀聯(lián)合其他藥物可以增強其治療膠質瘤的效果并減少其副作用[3，8-9]。褪黑素能夠抑制膠質瘤細胞增殖，并誘導細胞凋亡[10]。研究還表明，褪黑素可以通過調節(jié)miR-6858 的表達抑制膠質瘤細胞侵襲和遷移[11]。因此，本研究擬通過體外實驗研究褪黑素對尼莫司汀化療增敏效應，并探明其機制，以期發(fā)現(xiàn)新的治療膠質瘤的方案。

本研究顯示，褪黑素、尼莫司汀單獨或者協(xié)同給藥對膠質瘤U118 細胞均具有生長抑制作用。協(xié)同實驗中，褪黑素(0.75 mmol/L)聯(lián)合尼莫司汀(100 μmol/L)時，U118 細胞的CDI 為0.43。由此可見，一定濃度的褪黑素對尼莫司汀具有明顯的化療增敏效應。平板克隆實驗從細胞集落形成能力角度進一步證實了褪黑素能增強尼莫司汀對膠質瘤的抑制作用。

此外，COX-2 表達與膠質瘤對化療抵抗和預后相關[3，12]。COX-2 是前列腺素合成的關鍵酶，在正常組織細胞中一般不表達或者低表達，在膠質瘤細胞中高表達[12]。COX-2主要定位于核膜，其催化產(chǎn)生的前列腺素類物質產(chǎn)物可進入核內(nèi)，調節(jié)靶細胞基因的轉錄。COX-2通過促進血管生成及轉移、抑制機體免疫等促進腫瘤惡性進展[13]。Cox-2 基因為誘導性表達，其啟動子含有NF-κB的結合位點，NF-κB與轉錄共激活因子CBP/p300能結合于該位點并上調COX-2的表達[14]。研究結果發(fā)現(xiàn)，褪黑素可增強尼莫司汀抑制U118細胞中COX-2 mRNA和蛋白的表達。

NF-κB信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉導系統(tǒng)，屬于受調蛋白水解酶依賴的受體信號轉導通路。在未受刺激的細胞中，NF-κB與IκB蛋白結合在一起滯留在細胞質中。在未受刺激的細胞中，NF-κB轉錄因子與抑制性IκB 蛋白結合在一起，因而被滯留在細胞質中[15]。上游信號的刺激導致IκB 蛋白在IKK的作用下被磷酸化修飾，繼而被泛素連接酶復合體識別，促使IκB 蛋白以蛋白酶體依賴的方式被降解，NF-κB 從而被釋放出來，進入細胞核并啟動靶基因的表達[15]。NF-κB 信號通路在膠質瘤惡性進展中起著重要的作用[16-18]。在本研究中，褪黑素可增強尼莫司汀抑制U118細胞中p-IκBα/IκBα的表達。

綜上所述，褪黑素可增強尼莫司汀對膠質瘤U118細胞增殖的抑制作用，初步證實兩種藥物相結合治療膠質瘤的應用潛力。兩種藥物相結合通過抑制NF-κB信號通路，抑制COX-2 mRNA 和蛋白的表達，從而抑制膠質瘤增殖，為膠質瘤的治療提供新的潛在方案。本研究缺少動物實驗，同時并未闡明NF-κB信號通路在這一過程中是否起決定性作用。本課題組下一步將對褪黑素增強尼莫司汀抑制膠質瘤增殖的分子機制展開進一步研究，并開展相關動物實驗，以期為臨床應用褪黑素聯(lián)合尼莫司汀治療膠質瘤提供理論依據(jù)。